基于16S rRNA全长高通量测序分析桶子鸡中细菌多样性

摘要 ［目的］研究不同加工过程桶子鸡所携带的微生物多样性及菌落组成。［方法］采用PacBio三代全长高通量测序技术，对桶子鸡样本所携带细菌的16S rRNA的V1-V9区进行测序后进行统计分析。［结果］共获得67 287条有效序列，2 300个OTU数目，不同加工环节的桶子鸡中细菌群落存在差异。在门水平上，共获得15个细菌门，优势菌主要为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、疣微菌门（Verrucomicrobia）；在属水平上，共获得250个细菌属，优势菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、环丝菌属（Brochothrix）、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、Janthinobacterium、黄杆菌属（Flavobacterium）、希万氏菌属（Shewanella）、Kaistella、冷杆菌属（Psychrobacter）；在种水平上，共获得621个细菌种，优势菌种为Sediminibacterium magnilacihabitans、慢生根瘤菌sp011516665、Bradyrhizobium sp011516665、Pseudomonas fragi、干酪巨球菌（Macrococcus caseolyticus）、希瓦氏菌（Shewanella baltica）等。［结论］同一加工环境中获得的老汤复煮桶子鸡、放置12 h桶子鸡和老汤3个样本中携带的优势菌群组成存在一定相似性，但相对丰度存在一定差异。生鲜鸡及另一加工场所制作的刚出锅桶子鸡的优势菌组成与其他样本有很大差异。

关键词 桶子鸡;细菌;16S rRNA;三代全长;高通量测序;微生物多样性

中图分类号 TS 251.6  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）20-0148-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.037

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

High-Throughput Sequencing Analysis by 16S rRNA of Bacterial Diversity in Bucket Chicken

XU Yan-yan，DONG Yu

（Kaifeng Center for Food and Drug Quality and Safety，Kaifeng，Henan  475000）

Abstract ［Objective］To study the microbial diversity and the microbial community composition of bucket chicken at different processing.［Method］The V1-V9 region of 16S rRNA of the bacteria in the bucket chicken samples were sequenced by the PacBio full-length high-throughput sequencing technology.［Result］The 67 287 effective sequences and 2 300 OTU were obtained.There were some differences in the bacterial communities of the bucket chicken in different processing stages.A total of 15 bacterial phylum were obtained and the dominant bacteria are Proteobacteria，Bacteroidetes and Actinobacteria，Firmicutes，Deinococcus-Thermus，Verrucomicrobia;at the genus level，a total of 250 bacterial genus were obtained，the dominant bacteria genus were Pseudomonas，Acinetobacter，Staphylococcus，Brochothrix，Mesorhizobium，Janthinobact erium，Flavobacterium，Shewanella，Kaistella，Psychrobacter;at the species level，a total of 621 bacterial species were obtained，and the dominant species were Sediminibacterium magnilacihabitans，Bradyrhizobium sp 011516665，Pseudomonas fragi，Macrococcus caseolyticus，Shewanella baltica.［Conclusion］The microbial communities in the three samples of recooked bucket chicken，12-hour bucket chicken and soup obtained in the same processing environment were similar，but there are some differences in relative abundance.The dominant bacterial composition of fresh bucket chicken produced at another processing site and fresh chicken was different from other samples.

Key words Bucket chicken;Bacterium;16S rRNA;Full-length;High-throughput sequencing;Microbial diversity

桶子鸡是古都开封的一道特色名菜，是我国传统卤禽肉制品的典型代表，因其形似圆桶而得名。桶子鸡颜色鲜黄，口感咸香嫩脆，肥而不腻，越嚼越香，通常现做现食，深受消费者的喜爱［1］。鸡肉本身富含蛋白质、脂肪等营养成分，水分活度较高，虽然桶子鸡在煮制过程中采用高浓度盐卤，但煮制温度较低，仅能杀死耐热性较低的腐败菌及致病菌的营养体，而芽孢和耐热性微生物仍可存在。在产品贮存、运输和销售过程中，当条件适宜时，极易因微生物的大量增殖而导致产品的腐败变质，因此常温下其货架期较短，货架期问题成为制约其跨地域发展的重要因素。食品安全国家标准熟肉制品GB 2726—2016中对熟肉制品的菌落总数、大肠菌群及致病菌等有明确的限量规定。刘欣等［2］（2019年）利用抗菌肽（乳酸链球菌素）对桶子鸡的保鲜效果进行研究，结果表明，不同温度下贮藏的桶子鸡随着贮藏时间的延长，菌落总数、pH、TVB-N值、TBA值等指标均呈上升趋势，可通过抑制桶子鸡中微生物的繁殖进而延长桶子鸡的贮藏时间。因此，桶子鸡加工过程中细菌多样性的研究对于从源头把控细菌污染、繁殖及延长桶子鸡货架期，进而保障桶子鸡的食品安全具有一定的理论指导意义。

高通量测序技术在短时间内可测序大量核酸分子，不仅可检测出普通微生物还能检测出不易培养、丰度低和一些难以分离的微生物［3-4］，能够更好地解释微生物菌群的组成和多样性，具有检测快速、通量高、灵敏度高等优点［5］。二代、三代高通量测序技术被应用于食品领域，其研究对象包括肉制品、水产品及发酵类食品。16S rRNA普遍存在于原核生物中，共有10个保守区和9个高可变区，因此兼具特异性和保守性的16S rRNA被广泛应用于细菌高通量测序研究。基于电信号而不是光信号的三代高通量测序技术采用的是纳米孔单分子技术，不需要 PCR 扩增，测序读长比一代、二代测序技术长［6］。通过多重比对方法获取环形一致序列（circular consensus sequence，CCS）弥补了自身容易出现单个碱基错误的缺陷，将其错误率降低至可接受的范围内，选择99%的相似度作为预聚类阈值可以排除错误碱基的影响［7］。因三代测序技术可以覆盖16S rRNA的9个高变区域，避免了仅选取V4、V3-V4、V4-V5、V1-V3、V3和V4-V6单个或多个可变区分段扩增所带来的局限性。基于SMRT测序技术的微生物16S rRNA基因全长测序可以有效提高环境微生物研究的分辨率［8］，将更多微生物注释到种水平，并提高物种丰度预测的准确性。

目前，国内外利用高通量测序技术对桶子鸡加工过程中细菌多样性的研究较为少见。笔者利用三代全长高通量测序技术分析不同加工环节中桶子鸡所携带的细菌菌群组成情况，为后期生产加工中关键控制点的制订，选择有针对性的抑菌防腐剂，进而延长产品货架期提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品。桶子鸡的制作选用生长期1～3年的健康母鸡，经开小口取内脏、老汤浸煮等传统工艺制作而成。为研究不同加工环节中桶子鸡表面菌群多样性，选取5个代表性样本。刚出锅桶子鸡来源于河南省开封某地区某桶子鸡熟食店，为0号样本，老汤复煮5 min桶子鸡为1号样本，于加工场所冷库内放置12 h桶子鸡为2号样本，煮制桶子鸡专用老汤为3号样本，用于加工桶子鸡的冷鲜鸡为4号样本，4个样本均来源于河南省开封某地区某桶子鸡加工厂，其中老汤复煮5 min桶子鸡为研究专用样本。

1.1.2 试剂。DNA抽提试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司）；琼脂糖（法国Biowest公司）；PCR试剂盒（北京TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase）；凝胶回收试剂盒（美国Axygen）；建库试剂盒（美国Pacific Biosciences）。

1.1.3 仪器。微量冷冻离心机（美国Thermo）；台式高速离心机（德国Eppendorf）；超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific）；质谱仪（美国Thermo）；磁力架（美国Invitrogen）；蛋白电泳仪（美国 Bio-Rad）；超声波核酸打断仪（美国 Covaris）；凝胶成像仪（中国Tanon）；核酸电泳仪（中国Tanon）;PCR仪（美国ABI GeneAmp 9700型）；测序仪（美国Pacific Biosciences）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理。于某桶子鸡熟食店选取刚出锅桶子鸡（0号样本），于某桶子鸡加工厂选取冷库放置12 h桶子鸡（2号样本），冷库放置12 h桶子鸡再经老汤复煮5 min后制得老汤复煮桶子鸡（1号样本），制作桶子鸡的冷鲜鸡（4号样本）数只，分别用无菌棉签擦拭其表面，后用无菌棉签蘸取适量制作桶子鸡的老汤（3号样本），共5个样本分别置于无菌袋中常温运输，于4 ℃保存。

1.2.2 样品DNA的提取和扩增子的制备。 参照E.Z.N.A. Soil DNA Kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.） 试剂盒说明书，提取5个样本中的微生物组总DNA。采用16S rRNA全长通用引物，27F（上游引物） 5′-barcode-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）-3′和1492R（下游引物） 5′-CRGYTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增，每个样本的扩增引物含有8碱基标签序列，用以区分样本。PCR反应体系总体积为20 μL∶4.0 μL的5×FastPfu Buffer，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，上、下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，以及10 ng模板 DNA。 PCR扩增试验程序如下：95 ℃下进行5 min;在95 ℃下进行30 s，在58 ℃下进行30 s，在72 ℃下进行45 s，上述步骤进行30个循环，最后 72 ℃保持10 min，临用前置于10 ℃。每个样本3次重复，后将同一样本的3个PCR扩增产物混合后经2%琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris HCl洗脱;后采用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.） 试剂盒参照说明书操作流程进行纯化。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求进行相应比例的混合。