3种石斛种子无菌播种快繁技术

摘要 为了解鼓槌石斛、细茎石斛和球花石斛种子无菌播种快繁技术，以3种石斛种子为研究对象，探讨不同培养基、激素种类以及浓度配比对3种石斛种子无菌萌发、原球茎增殖和种苗壮苗生根的影响。结果表明：3种石斛种子的萌发率最高均在1/2MS基础培养基和添加10%马铃薯的1/2MS培养基上；鼓槌石斛和球花石斛原球茎增殖培养基以1/2MS+10%马铃薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA最佳，细茎石斛原球茎增殖培养基以1/2MS+10%马铃薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA最佳；鼓槌石斛生根壮苗培养基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂最佳，球花石斛和细茎石斛的生根壮苗培养基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂最佳。

关键词 石斛属；无菌萌发；原球茎增殖；壮苗生根

中图分类号 S 567.23  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）20-0155-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.038

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Rapid Propagation Technique of 3 Kinds of Dendrobium Seeds

LINGHU Ke-nian，YANG Yan-bing，YAN Feng-xia et al

（Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Karst Mountainous Areas of Southwestern China，Guizhou Academy of Forestry，Guiyang，Guizhou 550005）

Abstract To understand the Dendrbium chrysotoxum，Dendrobium moniliforme and Dendrobium thyrsiflorum seed sterile plant rapid propagation techniques，in this paper，three kinds of Dendrobium seeds as the research object，discusses different types of medium，hormone and concentration ratio of 3 kinds of Dendrobium sterile seed germination，protocorm proliferation and seedling seedling rooting effect.The results showed that the highest germination rate of the 3 Dendrobium seeds was on 1/2MS base culture and 1/2MS medium with 10% potato.Dendrobium chrysotoxum and Dendrobium thyrsiflorum were optimized with 1/2MS +10% potato +0.50 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，while Dendrobium moniliforme was optimized with 1/2MS +10% potato +1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The best rooting and seedling medium of Dendrobium chrysotoxum moniliforme was 1/2MS+0.10 mg/L IBA+10% potato +2.0% sucrose +0.6% AGAR，and the best rooting and seedling medium of Dendrobium thyrsiflorum and Dendrobium moniliforme was 1/2MS+0.50 mg/L IBA+10% potato +2.0% sucrose +0.6% AGAR.

Key words Dendrobium spp.;Sterile germination;Protocorm proliferation;Strong seedling rooting

石斛（Dendrobium spp.）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium Sw.）植物的总称，全世界约有1 500个原始种，13 600余个杂交种［1-2］。早期记载我国共有72种和2个变种［3］，但随着新种和新纪录的发现，我国石斛属植物已上升至81种，分布在西南、华南等热带、亚热带地区以及秦岭以南各省［4］。石斛茎含有生物碱、多糖、黄酮等多种药用成分［5］，具有良好的抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖以及提高免疫力等药用功效［6-8］，是著名的传统中药材。同时，由于石斛种类繁多、花形多样、花色丰富、花期长，亦极具观赏价值，民间常称“石斛兰”，是世界“四大洋兰”之一［9-11］。

作为附生的兰科植物，对环境要求严［12-13］，高度特化与艳丽的花特征，致使其传粉受精需要特定形态昆虫，自然状态下授粉困难，结实率低；此外，其种子无胚乳，需特定的共生菌为其提供营养才能正常萌发，自然更新困难［14-16］。加之人为过度采挖，受威胁严重，野生资源极度稀少，在《中国生物多样性红色名录——高等植物卷（2020）》中已有42种石斛被评估为极危（CR）或濒危（EN）物种，且2021年9月发布的《国家重点保护植物名录》中，石斛所有种均列为国家重点保护植物。因此，开展石斛扩繁技术研究对石斛资源保护意义重大。

目前，石斛主要依靠分株繁殖，繁育能力低下且生长缓慢，存在繁殖系数低、周期长等缺陷［16］。近年来，随着组培快繁技术快速发展，翅萼石斛、铁皮石斛等均突破了快速扩繁技术瓶颈，并取得了显著成效［17-18］，为石斛资源的保育与可持续利用提供了重要基础。鉴于此，笔者以鼓槌石斛、细茎石斛和球花石斛3种石斛种子为材料，探讨不同的基础培养基、天然有机添加物、激素种类和激素浓度配比对石斛种子萌发率、原球茎增殖以及生根壮苗等的影响，旨在通过快繁技术建立3种石斛的规模化技术体系，为石斛资源的保育与可持续利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自贵州省林业科学研究院贵州·石斛种质资源库，是经人工授粉后的鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）、细茎石斛（Dendrobium moniliforme）和球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）的蒴果。其中，鼓槌石斛5月中旬开花，7 d后进行人工授粉，11月初果实成熟，孕育期170 d；细茎石斛6—11月陆续开花，11月初开花，10 d左右进行人工授粉，次年6月中旬果实成熟，孕育期210 d；球花石斛6月初开花，7 d左右人工授粉，12月初果实成熟，孕育期160 d。

1.2 方法

1.2.1 培养条件。

试验采用MS、1/2MS、B5、1/2B5作为基础培养基，筛选最优基础培养基后附加一定量的植物生长调节剂（6-BA、NAA、IAA、IBA）和10%天然有机附加物（马铃薯、香蕉、玉米、大豆），所有培养基均以加入0.5 g/L活性炭、葡萄糖20 g/L（生根为10 g/L）及6 g/L琼脂作为固定剂，加热完全融化后调pH在5.2～5.4，分装入培养瓶中，每瓶40 mL，用瓶盖封口，每处理接种20瓶，放置于蒸气高压锅内（压力1.05 kg/cm2，温度121 ℃，维持20 min）消毒，室温冷却后待用。3种石斛种子无菌萌发各阶段培养基所含天然添加物、激素配比和浓度见表1。

1.2.2 培养环境。

接种材料各生长阶段的培养在培养室完成，将接种材料置于培养室中每层具2支40 W的日光灯的培养架上培养，培养室温度维持在（25±2）℃，光照强度30～40 μmol/（m2·s），光照时间12 h/d。

1.2.3 种子消毒。

建立无菌培养物时，外植体表面灭菌关系到试验成败，因此在石斛的组培研究中，待果实渐变为淡黄色时，剪取成熟未开裂饱满果实，先将石斛果实在自来水下冲洗3～4 h，乙醇消毒5 min，取出置于10％次氯酸钠溶液中浸泡5 min，之后用0.1％升汞溶液浸泡5 min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干表面水分，备用。

1.2.4 种子撒播与萌发。

在超净工作台上无菌条件下切开果皮，用接种器具将种子撒落于所配制的MS、1/2MS、B5、1/2B5固体琼脂培养基上，以筛选基础培养基对石斛种子萌发的影响；另将同一批种子分别接种于添加10%天然有机附加物马铃薯、香蕉、玉米和大豆的1/2MS基础培养上。

1.2.5 原球茎增殖与分化。

将原球茎转接于增殖分化培养基上，基础培养基选用1/2MS+10%马铃薯，并添加不同激素浓度6-BA和NAA（表1），观察3种石斛原球茎分化增殖情况。

1.2.6 壮苗生根。

当种子萌发培养基中石斛原球茎长出1 cm 及以上的芽后，将其转接至壮苗生根培养基中进行生根壮苗试验。培养基配方：以1/2MS+10%马铃薯+0.5 g/L活性炭+2.0%蔗糖+0.6%琼脂为基础培养基，并添加不同浓度IBA（0.05、0.10、0.50和1.00 mg/L）。

1.3 数据处理

采用Excel软件对试验数据进行统计处理。

萌发率=（萌发瓶数/接种瓶数）×100%

增殖率=（增殖数/接种数）×100%

生根率=（生根数/接种数）×100%

2 结果与分析

2.1 不同培养基对3种石斛种子萌发的影响

分别以MS、1/2MS、B5、1/2B5为基础培养基，将3种石斛种子（图1：A1、B1、C1）分别接种到不同萌发基础培养基D1～D4上（表2），接种后置于光照下培养28 d（图1：A2、B2、C2），可见种子由白色转为绿色，49 d叶原基长出，77 d后原球茎长成小芽（图1：A3、B3、C3），观察统计种子在各培养基中的萌发情况。结果发现（表2），3种石斛种子在1/2MS培养基上萌发数和萌发率最高，鼓槌石斛、球花石斛和细茎石斛的萌发率分别达到85%、65%和100%，以细茎石斛的萌发率最高，鼓槌石斛其次，球花石斛最低。

2.2 不同有机添加物对3种石斛种子萌发的影响

以1/2MS为基础培养基，将鼓槌石斛、球花石斛和细茎石斛种子分别接种到添加10%的马铃薯、香蕉、玉米、大豆4种培养基E1～E4上（表3）。由表3可知，种子接入以上培养基均能萌发，但萌发率各有不同。4种有机添加物中，3种石斛种子在添加10%马铃薯的培养基上萌发数和萌发率最高，萌发率高达85%及以上。其他3种有机添加物虽然萌发率均低于马铃薯，但并无褐化现象，原球茎之间不黏连，有利于转瓶继代培养。

2.3 不同激素组合对3种石斛原球茎增殖与分化的影响

以1/2MS为基础培养基，添加10%马铃薯及不同配比的激素组合（6-BA和NAA），将原球茎及带有叶芽的原球茎转接至不同激素组合及配比的培养基F1～F6上（表4、图1：A4、B4、C4）。鼓槌石斛培养基上原球茎及芽增殖速度较慢，少量植株有严重褐化现象，其余2种石斛均正常发育（图1：A5、B5、C5）。当细胞分裂素6-BA为0.2 mg/L条件下，NAA浓度为0.2 mg/L时，3种石斛植物的分化增殖率最高，之后随着NAA浓度的增加，3种石斛植株的分化均呈下降趋势，说明生长素NAA的浓度以0.2 mg/L为宜，NAA浓度≥0.5 mg/L有抑制植株分化的趋势。