丝瓜子房培养类胚体发生途径诱导研究

摘要  ［目的］以丝瓜（Luffa ssp.）品种“徐绿一号”的未授粉子房为试验材料，分析不同因素对类胚体形成的影响。［方法］设置L16（215）正交试验分析子房发育阶段、4 ℃预冷处理、35 ℃黑暗热激处理、TDZ、6-BA、ABA、NAA、2，4-D对丝瓜离体子房培养获得类胚体的影响。［结果］不同因素对子房片的发育过程具有不同的效果，其中采集当天开放的雌花、4 ℃预冷处理、在MS培养基中添加0.04 mg/L TDZ对子房片的类胚体形成具有促进作用，添加0.04 mg/L 2，4-D对丝瓜子房类胚体形成具有抑制作用，但可以促进子房片生根；另外预冷处理与TDZ、TDZ与雌花采集时间、4 ℃预冷和ABA的两两交互作用对丝瓜类胚体的形成也具有显著影响。［结论］有效形成丝瓜子房类胚体途径：当天采集子房+4 ℃预冷处理+0.04 mg/L TDZ。

关键词  丝瓜；离体子房；类胚体；单倍体；TDZ

中图分类号  S642.4  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）21-0044-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.009

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Induction Study on the Pathway of Embryoid Formation in Ovary Culture of Luffa ssp.

YAN Le-long， HUANG Yao， NI Wei-chen  et al

（Nanjing Agricultural University （Changshu） New Rural Development Research Institute Co.， Ltd.， Suzhou，Jiangsu  215500）

Abstract  ［Objective］To analyze the effects of different factors on embryoid formation using unpollinated ovaries of Luffa ssp. cultivar ‘Xulv No.1’ as experimental material. ［Method］ An L16（215） orthogonal test was set up to analyze the effects of ovary collection time， 4 ℃ cold pretreatment， 35 ℃ dark heat shock treatment， TDZ hormone， 6-BA hormone， ABA hormone， NAA hormone and 2，4-D hormone on embryoid formation in vitro cultured Luffa ssp. ovaries. ［Result］Different factors had different effects on the development process of ovary slices. Among them， collecting female flowers that opened on the same day and adding TDZ hormone to MS medium had a promoting effect on embryoid formation in ovary slices. However， 2，4-D hormone had an inhibitory effect on embryoid formation in Luffa ssp. ovaries but could promote rooting of ovary slices. In addition， the interaction between 4 ℃ cold pretreatment and TDZ hormone and between TDZ hormone and female flower collection time also had a significant effect on embryoid formation in Luffa ssp.. ［Conclusion］The effective way to form embryoids from Luffa ssp. ovaries is： collecting ovaries on day of flowering+4 ℃ cold pretreatment+0.04 mg/L TDZ hormone induction in vitro.

Key words  Luffa ssp.;In vitro ovary;Embryoid;Haploid；TDZ

基金项目  江苏省自主创新项目（CX202204）；常熟市科技项目（CN20-2204）。

作者简介  颜乐龙（1998—），男，湖南茶陵人，硕士，从事单倍体诱导技术研究。*通信作者，教授，博士，从事单倍体育种研究。

收稿日期  2023-12-17

丝瓜（Luffa aegyptiaca Miller）为葫芦科（Cucurbitaceae）丝瓜属（Luffa Mill.）一年生草本植物，其嫩瓜含有丰富的蛋白质、碳水化合物、氨基酸等物质，具有保健和美容的作用［1］；老瓜或藤蔓可用药，亦可加工，具有特殊的药用和工业价值［2］。丝瓜在我国南北均有种植，主要栽培种有普通丝瓜和有棱丝瓜2个类型［3］。近年来，丝瓜市场需求量不断增大，对丝瓜不同品种的需求也在扩大。

由于F1代的杂合特性，导致F1品种具有较高的产量和活力。因此市场的经济品种都是F1，而F1代通过不同纯系品种杂交而来。目前获得纯系的方法有2个，分别为传统自交和DH技术［4］。而传统的多年自交获得自交系成本高、时间长，这种育种方式限制了现代丝瓜育种的需求［5］。而通过单倍体诱导技术结合染色体加倍技术获得基因型纯合的双单倍体（DH）能缩短育种时间［6］。

创制葫芦科作物单倍体的方式主要有3种：辐射花粉授粉结合胚培养技术、离体子房/胚珠培养、花药/花粉培养［7］。通过这些手段已在甜瓜［8-9］、黄瓜［10］、南瓜［11］、西瓜［12］等作物上获得了单倍体。且在甜瓜作物上已有利用单倍体诱导技术培育新品种的报道［13］。单倍体育种能在较短的育种周期内纯化性状，加速育种进程。因此，构建丝瓜离体子房再生培养体系能加速丝瓜新品种培育。

笔者借鉴其他葫芦科作物（黄瓜、甜瓜等）的离体子房培养体系，以“徐绿1号”为材料，研究不同因素如子房发育阶段［9］、4 ℃预冷［10］、35 ℃黑暗热激以及不同种类激素对丝瓜离体子房培养获得类胚体和根形成的影响［14］，旨在构建一条有效的丝瓜离体子房培养获得类胚体途径，为后续的丝瓜离体子房获得单倍体研究提供借鉴。

1  材料与方法

1.1  试验材料

供试材料为“徐绿1号”，为常熟地方品种“徐筒玉”高代自交系和自选品系“LZ88”高代自交系杂交一代［15］，由南农大（常熟）新农村发展研究院有限公司提供。于2022年9—11月种植于常熟市农科所的连栋大棚内。

1.2  正交试验设计

试验涉及8个因素：子房发育阶段、35 ℃黑暗热激、4 ℃预冷处理、激素TDZ、6-BA、NAA、ABA、2，4-D，每个因素选取2水平进行 L16（215）正交试验，共16个处理（表 1），每个处理 3 次重复。试验数据采用 R语言进行统计分析和绘图。

根据表1的16种处理进行随机试验。于丝瓜植株的第二朵雌花盛开时开始采集子房，选择当天开花的雌花（图1b）或前1 d开始采集子房（图1a）。根据不同处理的要求对子房进行4 ℃预冷（1 d）处理；消毒处理：洗洁精清洗表面绒毛，流水冲洗15 min，75%乙醇消毒30 s，1 %的次氯酸钠溶液中浸泡8～9 min（视子房大小调整浸泡时间），无菌水反复冲洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干表面水分；对消毒好的子房进行横向切割，子房切片厚度为1～2 mm（图1d），子房切片接种在已添加不同激素种类的MS培养基（4.74 g/L MS+蔗糖30 g/L+琼脂2.5 g/L，pH 5.8～6.0）上进行培养；之后进行35 ℃黑暗热激或不进行处理（其中黑暗热激处理3 d），然后转入25 ℃、光照强度2 000 lx、16 h/8 h（光/暗）条件下培养［6］。

类胚体发生比例=类胚发生子房数量 /外植体总数

再生根形成比例=形成根的子房数 /子房培养数

1.3  再生根的倍性鉴定

子房切片培养60 d后，在超净工作台上进行取根，然后使用流式细胞仪鉴定再生根的倍性。

流式细胞仪鉴定倍性：取少量幼嫩根组织，置于预冷的培养皿中，加入缓冲液A，并用解剖刀将材料切碎，置于冰上继续裂解。裂解10 min后使用40 μm细胞筛网进行过滤，加入碘化丙锭和RNase，避光。使用BECKMAN流式细胞仪进行倍性鉴定。

2  结果与分析

2.1  子房切片产生类胚体和根

黑暗热激影响子房切片表面颜色。对采集的子房进行切片培养后，按照不同处理组合对外植体放置35 ℃暗环境或直接放置光照环境下进行培养。在接种培养3～7 d后，子房切片表面开始形成“隆起物”（图2a、2b），此时子房开始启动发育，而形成的“隆起物”为开始发育的类胚体。但不同培养条件下的子房切片表面的颜色不同，其中直接放置于自然光环境下的子房切片呈深绿色（图2a），而经过35 ℃热激暗培养的子房切片呈黄绿色（图2b）。培养15 d后，类胚体渐渐形成串状的形态（图2d）。将含有类胚体的切片转至胚分化培养基上后，出现了黄化、发育停止的现象。培养60 d后，接种在含有0.75 mg/L 2，4-D培养基的子房切片开始逐渐出现根（图2c）。

2.2  不同处理对根形成和类胚体的影响

由图3可知，不同处理类胚体和根的形成都有显著差异。其中处理①、处理②、处理⑦、处理⑧、处理B11、处理B12、处理B13、处理B14对根的形成具有积极影响；其余处理对根的形成几乎没有效果（图3a）。不同处理对类胚体的形成也有不同的效果，其中处理③对类胚体形成促进效果最佳（图3b）。同时，观察（图3a）发现，不同处理在类胚体的形成与根的形成上呈现相反的分布，且二者的相关系数为-0.49。为了解造成这种分布的差异，对各个因素进行了单因素方差分析。

2.3  不同因素对根形成和类胚体形成的影响

由图4和图5可知，子房发育阶段（图4、5a）、4 ℃预冷（图4、5b）、35 ℃黑暗热激（图4、5c）、基础培养基中添加TDZ（图4、5d）、6-BA（图4、5e）、ABA（图4、5f）、NAA（图4、5g）和2，4-D（图4、5h）激素对丝瓜子房生根影响具有差异，只有添加0.04 mg/L 2，4-D激素的培养基可以有效诱导丝瓜生根，其他未添加2，4-D的培养基较难诱导形成根系。因此，在丝瓜子房离体培养过程中MS培养基中添加2，4-D能有效诱导根系的产生。

在类胚体形成过程中，4 ℃预冷、培养基中添加NAA和2，4-D对该过程均有显著影响。在培养基中添加生长素类激素（NAA、2，4-D）和ABA激素对类胚体的诱导具有负向作用，而TDZ对类胚体的诱导具有正向作用。对比（图4h）和（图5h），发现2，4-D激素在根诱导和类胚体诱导上存在负相关关系。此外4 ℃预冷也能提高类胚体诱导效率。