灰毡毛忍冬SS基因的克隆及表达分析

摘要  ［目的］克隆灰毡毛忍冬SS基因全长序列，并进行生物信息学和表达模式分析。［方法］提取灰毡毛忍冬花总RNA，通过RT-PCR和RACE技术克隆LmSS基因的全长cDNA序列；运用相关软件对该基因序列进行生物信息学分析；利用qRT-PCR测定灰毡毛忍冬茎、叶和不同花期花中该基因的相对表达量。［结果］克隆的LmSS基因开放阅读框（ORF）长度为1 245 bp，编码414个氨基酸，属于亲水性蛋白，定位于细胞质中，具有典型的多聚异戊二烯基合成酶活性结构域，与其他植物SS基因具有较高同源性。LmSS基因在灰毡毛忍冬不同花期和器官中表达有组织特异性。［结论］该研究成功地克隆灰毡毛忍冬中的SS基因，为进一步研究该基因的功能奠定基础，同时为探究灰毡毛忍冬皂苷生物合成和调节机制提供了科学依据。

关键词  灰毡毛忍冬；鲨烯合酶（SS）；基因克隆；生物信息学；表达分析

中图分类号  S567.7+9  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）21-0071-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.015

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of Squalene Synthase Gene in Lonicera macranthoides

CHEN Xun1，WANG Shan2，LONG Yu-qing3 et al

（1. Affiliated Nanhua Hospital， University of South China， Hengyang， Hunan 421002;2.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005;3.School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan  410208）

Abstract  ［Objective］To clone the full-length sequence of the squalene synthase gene and perform bioinformatics and expression pattern analysis from Lonicera macranthoides. ［Method］Total RNA was extracted from Lonicera macranthoides， and the full-length cDNA sequence of LmSS gene was cloned using RT-PCR and RACE techniques， bioinformatics analysis was conducted on the gene sequence using relevant software， the relative expression of the gene in stem， leaf， and different flower period was determined by using Real-time PCR. ［Result］The open reading frame （ORF） of LmSS gene was 1 245 bp， encoding 414 amino acids.It belongs to a hydrophilic protein and is located in the cytoplasm. LmSS gene has a typical polyisoprene synthase active domain ， which has high homology with other plant SS genes. The expression of LmSS gene is tissue-specific in different flowering stages and organs of Lonicera macranthoides. ［Conclusion］This study successfully cloned the SS gene in Lonicera macranthoides， laying a foundation for further research on its function and providing a research basis for exploring the biosynthesis and regulatory mechanism of saponins in Lonicera macranthoides.

Key words  Lonicera macranthoides Hand.-Mazz;Squalene synthase （SS）;Gene cloning;Bioinformatics;Expression analysis

基金项目  湖南省自然科学基金项目（2021JJ30497）；湖南省教育厅资助科研项目（16B193）；湖南省自然科学基金联合项目（2024JJ8221）；湖南省中医药科研计划项目（D2022134）；湖南省教育厅科学研究项目（21C0245）。

作者简介  陈勋（1995—），男，湖南衡阳人，主管药师，硕士，从事中药资源质量与开发研究。

*通信作者，教授，博士，博士生导师，从事中药资源与质量研究。

收稿日期  2024-06-25

灰毡毛忍冬来源于忍冬科多年生藤本植物，归于山银花之下，其入药部位为干燥花蕾或带初开的花［1］。灰毡毛忍冬中含有的2种皂苷灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙是山银花的指标性成分，同时灰毡毛忍冬中也含灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬次皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷丙等多种皂苷类成分［2-3］。有研究表明，灰毡毛忍冬的皂苷类成分具有保护肝脏、抑制肿瘤、免疫调节和抗过敏、清除自由基抗氧化等多种药理作用［3］。

灰毡毛忍冬皂苷属于齐墩果烷型五环三萜类化合物［4］，而鲨烯合酶（squalene synthase，SS）在植物三萜类生物合成过程中起到关键作用，可以催化法呢酯焦磷酸缩合产生鲨烯，鲨烯是生成三萜类化合物重要的前体物质［5］。有研究者克隆出蒲公英的SS基因，并构建了TaSS 过表达载体，提高了转基因株系中蒲公英甾醇（齐墩果烷型五环三萜类化合物）含量［6］。将构建的三七SS基因超表达载体，利用农杆菌介导法导入三七细胞中，结果转基因细胞中的皂苷含量均显著增加［7］。在西洋参的各组织器官中，SS基因的表达量有显著差异，与其皂苷含量呈正相关［8］。由此可见，鲨烯合酶在植物三萜类化合物生物合成过程中发挥着重要作用，其含量可影响后续产物的合成，提高鲨烯合酶的活性，增加三萜类化合物的含量［5］。笔者根据课题组前期灰毡毛忍冬的转录组数据，筛选注释为squalene synthase的Unigene基因，成功克隆得到LmSS基因的全长序列，通过在线软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析，测定不同花期、不同器官的SS基因相对表达量，以期为探明鲨烯合酶在灰毡毛忍冬三萜生物合成途径中的作用奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

灰毡毛忍冬种植于湖南中医药大学药植园，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为灰毡毛忍冬，采收其新鲜茎、叶及花，用装有液氮的泡沫盒运回实验室，将样品分类后用密封袋封口，保存于-80 ℃超低温冰箱。

1.2  试药

多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，杭州博日科技有限公司；DNA回收试剂盒，康为世纪生物科技有限公司；反转录试剂盒，Thermo；pEASY-T1 Cloning Vector，北京全式金生物科技有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector，北京全式金生物科技有限公司；TranStart Green qPCR SuperMix UDG，北京全式金生物科技有限公司；RACE试剂盒，Clontech。所用引物见表1（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）。

1.3  试验方法

1.3.1  LmSS基因核心片段扩增。

用液氮预冷研钵，加入适量灰毡毛忍冬花蕾充分研磨，用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取花蕾的总RNA，将质量较好的RNA用反转录试剂盒逆转录合成cDNA的第一链。

在转录组Unigene基因序列中，选取注释为squalene synthase的序列，用Primer Premier 5.0设计特异性引物SS-F和SS-R（表1）。PCR反应体系和反应条件参考文献［9］，用DNA回收试剂盒对目的条带进行回收，将回收的 PCR 产物进行载体连接和转化，载体选用pEASY-T1 Cloning Vector，挑选白色菌落进行阳性克隆检测，根据菌落PCR结果，将阳性克隆接种于液体培养基中，培养过夜后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.2  LmSS基因3′和 5′端RACE扩增。

以“1.3.1”中的总RNA为模板，按照RACE试剂盒说明书分别获得LmSS基因的5′and3′-RACE-Ready cDNA，稀释后保存于-20 ℃冰箱备用。根据“1.3.1”测序结果，设计RACE特异性引物SS-3′和SS-5′（表1），RACE的PCR反应体系和反应条件参考文献［9］，目的条带回收、载体连接和转化、菌液PCR、测序等过程同“1.3.1”，载体选用pEASY-Blunt Cloning Vector。

1.3.3  LmSS基因cDNA全长序列验证。

根据“1.3.2”获得的LmSS全长序列，在其开放阅读框（ORF）中，设计全长验证引物V-SS-F和V-SS-R（表1）。全长验证PCR的反应体系和反应条件参考文献［9］，以“1.3.1”中获得的cDNA为模板，目的条带回收、载体连接和转化、菌液PCR、测序等过程同“1.3.1”，载体选用pEASY-Blunt Cloning Vector。

1.3.4  生物信息学分析。

根据LmSS基因的全长序列，采用在线软件ORF finder查找开放阅读框；ProtParam分析蛋白理化性质；ProtScale预测蛋白的亲/疏水性；TMHMM 2.0预测蛋白跨膜结构；SignalP 4.1 Server预测蛋白信号肽；WOLF PSORT预测蛋白亚细胞定位；NetPhos-3.1预测蛋白磷酸化位点；CD-Search预测蛋白结构域；SOPMA和SWISS-MODEL分别预测蛋白的二、三级结构；MEME预测蛋白保守基序。

1.3.5  LmSS基因的表达量分析。

按照“1.3.1”中的方法，用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒分别提取灰毡毛忍冬茎、叶和7个不同花期花（花蕾初期、青绿色花蕾期、绿白色花蕾期、白色花蕾期、白色开花期、金黄色开花期、枯萎期，见图1）的总RNA，将RNA定量后，反转录成cDNA作为模板。根据LmSS基因序列，设计荧光定量PCR的特异性引物Q-SS-R和Q-SS-F（表1）。荧光定量PCR的反应体系和反应条件参考文献［9］，反应结束后用2-ΔΔCT计算基因的相对表达量。