蝉虫生真菌的分离纯化及鉴定

摘要  为了解蝉的寄生真菌种类，通过分离和鉴定蝉体内虫生真菌，观察其主要特征并对其进行分子生物学鉴定，为蝉的绿色生物学防治提供一定的理论依据。从感染真菌的蝉体内分离纯化出几株病原真菌，命名为Y1、 Y3和Y6，并对其进行形态学观察及核糖体DNA序列测序及分析，对其进行鉴定和分析。由形态学可知，真菌Y1和Y3菌落颜色为黄棕色，菌丝白色，孢子黄棕色，圆形，大小均匀，经过ITS序列比对，结合形态特征，其为Scopulariopsis alboflavescen属真菌。Y6菌落颜色为白色，PDA培养基上菌丝短而致密，生长缓慢，显微镜下观察其菌丝为无色，孢子圆形或椭圆形，大小均匀，经过ITS序列比对，结合形态学特征，确定为Scopulariopsis属真菌。

关键词  蝉；寄生真菌；鉴定；Scopulariopsis alboflavescen；Scopulariopsis

中图分类号  S476  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）21-0078-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.016

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation，Purification and Identification of Parasitic Fungi in Cicada （Hemiptera： Cicadidae）

PENG Hu1，3，CHEN Jin-hua1，2，3，WEI Yun1

（1.College of Environmental Science and Engineering，China West Normal University，Nanchong，Sichuan 637000; 2.State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130;3.Triticeae Research Institute，Sichuan Agricultral University，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract  In order to understand the types of parasitic fungi in cicadas，we isolated and identified entomophytic fungi in cicadas，then observed their main characteristics，sequenced and analyzed ITS sequences of the strains.Several pathogenic fungi were isolated and purified from the cicada infected with fungi，named Y1，Y3，and Y6，and their morphology was observed，ribosomal DNA sequencing and analysis were performed to identify and analyze them.Morphologically，it can be inferred that the colonies of fungi Y1 and Y3 are yellow brown in color，with white hyphae and yellow brown spores.They are round and uniform in size.After ITS sequence alignment and combined with morphological characteristics，they belong to the Scopulariopsis alboflavescen genus of fungi.The color of Y6 colony is white，and the hyphae on PDA medium are short and dense，growing slowly.When observed under a microscope，the hyphae are colorless，and the spores are round or elliptical，with uniform sizes.After ITS sequence alignment and combined with morphological characteristics，it is classified as a Scoporariopsis fungus.

Key words  Cicada;Parasitic fungi;Identification;Scopulariopsis alboflavescen;Scopulariopsis

基金项目  国家自然科学基金项目（32100163）；校科研基金项目（11A022）;博士启动基金项目（20E043）。

作者简介  彭湖（1998—），男，四川遂宁人，硕士研究生，研究方向：病原微生物学。*通信作者，讲师，博士，从事病原微生物学研究。

收稿日期  2024-02-23

蝉（Cicadidae）是昆虫纲，半翅目，蝉科（Hemiptera： Cicadidae）的昆虫。其活动范围广泛，全球均有分布，全世界有180个属，2 000余个种类［1］。在我国，蝉科昆虫从南到北均有分布，其危害宿主种类很多，包括苹果树、梨树、樱桃、杏、枣、柑橘等多种果树，杨树、柳树、榆树、茶树等观赏树木或经济作物［2-3］。蝉是吸汁性害虫，主要以幼虫虫态危害植物根部及幼嫩部分，成虫虫态在树枝产卵繁殖，严重影响林木的生长，危害其产物的数量和品质［2-3］。对蝉科害虫的防治方法很多，第一类是不同化学药剂，如吡虫啉和苦参碱、扑虱灵和氟氯氰菊酯乳油、阿维菌素乳等［4-6］。第二类是生物防治策略，生物防治包括天敌防治，比如使用寄生蜂、蜘蛛、螳螂等［7-9］，以及微生物的防治方法，比如使用大孢巴科霉（Batkoa major）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）［10］。化学防治方法，虽然效率较高，但容易对环境造成污染，影响非靶标的生物，包括其他昆虫和人类健康，也可能影响天敌种群而导致害虫二次爆发。因此使用生物学的方法来防治害虫，专一性强，不易产生抗药性，对人类和生态环境绿色无毒。虫生真菌寄生在特定昆虫的幼虫或成虫体内［11］，通常对人类、非靶标生物安全无害，而且能够在害虫中，自然条件下广泛流行，因此在农业和林业害虫生物防治过程中发挥着重要作用［12-13］。笔者分离自然界中蝉的虫生真菌，通过形态学和分子生物学进行种类鉴定，对进一步利用虫生真菌绿色防治蝉等害虫提供菌种资源。

1  材料与方法

1.1  样品采集

蝉的僵虫采自四川省射洪市乡村自然生长的柏树。僵虫体表布满乳黄色或白色菌丝，使用无菌袋带回实验室。采集的僵虫在室内阴干30 d后置于无菌纸盒中，室温条件下存放。

1.2  蝉虫生真菌寄生现象观察

用针灸针挑取蝉体表的分生孢子，切取1小块马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），置于灭菌的载玻片上，置于超净工作台的显微镜下观察。镜检发现圆形的分生孢子。

1.3  蝉虫生真菌分离

配置PDA培养基（potato dextrose agar medium），加氨苄青霉素至终浓度为100 μg/mL。超净工作台上，使用无菌剪刀剪一小块蝉僵虫组织，使用75%乙醇浸泡5 s，再用无菌水冲洗3次，使用无菌接种环挑取孢子，在PDA培养基上划线分离纯化，在25 ℃的培养箱中培养，通过多次划线分离单菌落，从而获得纯培养。

1.4  菌落及菌丝、孢子形态观察

纯培养真菌在培养基上生长6 d后，观察菌落形态。切取菌落边缘小块菌丝，在载玻片上压片，使用徕卡光学显微镜（Leica DMi8，美国）观察菌丝和孢子发育情况。使用灭菌的无纺布将孢子过滤，置于血球计数板或普通载玻片上，利用光学显微镜进行观察。

1.5  PCR扩增虫生真菌ITS序列及分析

将灭菌玻璃纸铺在PDA培养基上，接种纯化的真菌，于25 ℃培养箱中培养5～7 d，揭开玻璃纸，收获菌体，使用CTAB法提取真菌基因组DNA。使用通用引物扩增真菌rDNA基因ITS序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［14］，PCR扩增体系为50 μL，包含真菌基因组DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），10×Taq Plus Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μL（天根生化科技（北京）有限公司，中国北京），Taq Plus DNA Polymerase （2.5 U/μL） 0.5 μL，ddH2O补足为50 μL。使用PCR热循环仪（赛默飞，美国）进行扩增，反应程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s， 30个循环，最后 72 ℃延伸 5 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，获得清晰的单一预期条带后直接送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将所获序列在 NCBI 的 GenBank 数据库中与已知序列进行 Blast 比对。选择与该试验得到的菌株相似性较高的其他真菌ITS序列，利用 Mega 11.0 软件进行系统分析，用邻接法（Neighbor-joining method，N-J 法）构建 ITS 序列的系统进化树［15］。

2  结果与分析

2.1  虫生真菌形态观察

分离纯化得到了3个虫生真菌菌株，分别命名为Y1、Y3和Y6。其中，菌株Y1 在 PDA 培养基上丝状菌丝呈放射性生长，菌丝最初为白色，短而致密，生长缓慢，有分支和分隔，待菌落开始产孢后，逐渐变为黄棕色，孢子为黄棕色，菌落背面和正面颜色相同，都是黄棕色。具有3级分生孢子梗，孢子圆形，如图1所示。

真菌菌株Y3形态与Y1相似，在 PDA 培养基上菌丝放射性生长，最初为白色，短而致密，生长缓慢，菌丝有分支分隔，孢子为黄棕色，菌落背面也为黄棕色。具有3级分生孢子梗，孢子圆形，如图2所示。

真菌菌株Y6在 PDA 培养基上菌丝为白色，短而致密，生长缓慢，菌丝有分支分隔，孢子为白色，菌落正面背面都是白色。分生孢子发育时，分生孢子梗末端膨大，孢子圆形或椭圆形，如图3所示。

2.2  蝉虫生真菌的ITS序列

使用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株Y1、Y3和Y6的基因组DNA进行PCR扩增，均获得了大小约600 bp的单带，将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。虫生真菌Y1的ITS序列为609 bp，测序结果表明，与帚霉属真菌（Scopulariopsis alboflavescens）的相似度为98.29%，系统进化树将真菌菌株Y1与S.alboflavescens（ACCESSION NR_15620）聚类到一支（图4），初步鉴定虫生真菌Y1为S.alboflavescens属真菌。

虫生真菌菌株Y3的ITS序列为612 bp，在NCBI数据库中与帚霉属真菌Scopulariopsis alboflavescens相似度为98.45%，系统进化树将真菌菌株Y3与S.alboflavescens（ACCESSION NR_15620）聚类到一起（图5），初步鉴定菌株Y3为S.alboflavescens属真菌。

虫生真菌菌株Y6的ITS序列为642 bp，与福斯卡帚霉Scopulariopsis fusca相似度98.66%，与Scopulariopsis caseicola的相似性为98.75%，系统进化树将菌株Y6与S.caseicola

（ACCESSION NR_155811）、福斯卡帚霉S.fusca（ACCESSION NR_145258）聚类到一起（图6），初步认定其是一种S.caseicola属的真菌。

3  讨论

该研究所获得的3种蝉的虫生真菌，均为帚霉属Scopulariopsis属真菌，包括2株S.alboflavescens菌株和1株S.caseicola菌株。帚霉属有性期隶属于子囊菌门Ascomycota，真子囊菌纲Euascomycetes，小囊菌目Microascales，小囊菌科Microascacea。无性期隶属于半知菌亚门Deuteromycontina，丝孢纲Hyphomycetes，丛梗孢目Hyphomycetales，丛梗孢科Moniliaceae。