微滴式数字PCR技术在菜豆晕疫病菌检测中的应用

摘要  为了建立菜豆晕疫病菌（Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola）微滴式数字PCR（ddPCR）检测方法，实现菜豆晕疫病菌的高效率、高精度的检疫鉴定和疫情监控，以菜豆晕疫病菌为研究对象，以位点特异性重组酶作为靶标基因，SSRP_F、SSRP_R、SSRP_P为特异性引物与探针，建立菜豆晕疫病菌ddPCR反应体系，结果表明，菜豆晕疫病菌的ddPCR检测体系的绝对定量检测低限为0.6 copies/μL，ddPCR的检测灵敏度比常规PCR高2个数量级。同时研究了种子携带菜豆晕疫病菌是否具有活性，提高了疫情检出率。

关键词  微滴式数字PCR技术；菜豆晕疫病菌；快速检测

中图分类号  S432.4+2  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）21-0163-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.034

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Application of Droplet Digital PCR in the Detection of Pseudomonas savastanoi

LIU Xiao-yu，QIAN Zhu-xi，GUO Jing et al

（Animal，Plant and Food Inspection Center，Nanjing Customs，Nanjing，Jiangsu 210019）

Abstract  In order to realize high efficiency and high precision quarantine identification and epidemic monitoring of Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola （Psp），the detection method of Psp by droplet digital PCR （ddPCR） was established.The ddPCR reaction system was conducted with Psp as research object and site-specific recombinases were used as gene target with SSRP-F/SSRP-R/SSRP-P as primers and probe.The results showed that the detection limit of genomic DNA by ddPCR was 0.6 copies/μL.The detection sensitivity of ddPCR could increase two orders of magnitude than convention PCR.Meanwhile，the activity of Psp carried in peas was studied，which improved the epidemic detection rate.

Key words  Droplet digital PCR;Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola;Rapid detection

基金项目  南京海关科研项目（2022KJ22）。

作者简介  刘晓宇（1975—），女，蒙古族，辽宁朝阳人，高级农艺师，硕士，从事植物病原细菌检测工作。*通信作者，农艺师，硕士，从事植物病原真菌检测工作。

收稿日期  2023-11-14

菜豆晕疫病菌是由萨氏假单胞菜豆致病变种（Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola，Psp）引起的豆类作物上的细菌性病害［1］。该病菌广泛分布于大多数矮生菜豆种植的国家和地区，欧洲、美洲、非洲、大洋洲的大多数豆类种植国家和地区有报道，至今在各大洲的60多个国家和地区有分布［2-3］。菜豆晕疫病菌具有广泛的寄主群体，除普通菜豆外，还有大豆、豌豆、扁豆、赤豆、月豆、野葛、绿豆、豇豆等豆科自然寄主［3］。菜豆晕疫病菌主要通过带菌种子进行远距离传播，潜伏在种子内部或者附着在种子表面，并可存活2年以上［3-4］。病原菌的最适生长温度为25～30 ℃，中国各豆科作物产区均具备其定殖的条件［5］。2007年我国就将菜豆晕疫病菌列为禁止进境检疫性有害生物。

微滴式数字PCR技术（droplet digital PCR，ddPCR）是在传统PCR扩增前对样品进行微滴化处理，能够快速精准检测复杂样品中微量目标序列的一种新技术。ddPCR技术通过将微量样品进行大倍数稀释后，每个微滴作为一个独立的PCR体系，经PCR 扩增后，对每个微滴反应进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶标分子的起始拷贝数［6-9］。该试验采用微滴式数字PCR技术，针对进口豆类中风险高的病原细菌菜豆晕疫病菌开发超微量病原细菌核酸的快速、精准检测方法，旨在对进境豆类样品准确鉴定目标病原细菌，防止漏检，保护我国豆类作物，从而保护本地农业经济。

1  材料与方法

1.1  供试菌株及培养条件

试验用菌株共15株，菜豆晕疫病菌菌株LMG 2245由中国检验检疫科学研究院提供，菌株2435为厦门海关提供，菌株2706、3760、4450、231、1010-1、CM20、ATCC29076、NVPPB402、NCPPB4200由上海海关提供，其余均为南京海关动植物与食品检测中心植检实验室保存菌株。所有菌株均悬浮于30％甘油，保存在 -80 ℃冰箱中。菌株活化采用NA培养基于28 ℃培养3 d。所有参试菌株见表1。

1.2  仪器与试剂

微滴式数字PCR系统QX200 Droplet Digital PCR（Bio-Rad，美国）：微滴生成仪、微滴分析仪、封膜仪和Quanta Soft软件。微滴式数字PCR 试剂和耗材：ddPCR TM Supermix for Probes、微滴生成油、微滴生成卡槽、微滴生成卡槽胶垫和锡纸膜，以上均由美国Bio-Rad公司生产。天隆科技DNA自动提取仪；超微量核酸蛋白检测仪（NEDROB）；PCR扩增仪（美国 MJ Research）；摇床（702R A-PLUS，美国）。

1.3  PCR引物与ddPCR引物探针组合  PCR引物为PH19（5′-CGTCTGTAACCAGTTGATCC-3′）和PH95（5′-GAATCCTTGAATGCGAAGGC-3′）［10］，目的产物大小为437 bp；ddPCR引物为SSRP_F（5′-GACGTCCCGCGAATAGCAATAATC-3′）和SSRP_R（5′-CAACGCCGGCGCAATGTCG-3′），探针为SSRP_P（5′-FAM-TGACGTGACACTCGCCGAGCTGCA-TAMRA-N-3′）［11］。PCR引物、ddPCR引物与探针均委托生工（上海）生物科技有限公司合成。

1.4  PCR与ddPCR反应条件

PCR反应体系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，加无菌水补足至25.0 μL。反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s；72 ℃，60 s，35个循环；72 ℃，5 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳，染色后用凝胶成像系统分析。

ddPCR反应体系：ddPCR TM预混液（Supermix for Probes） 10 μL，核酸DNA模板1 μL，上、下游引物和探针各1 μL，无菌水补足至20 μL，随后将上述20 μL 反应液和70 μL微滴生成油加至微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴。最后将生成的微滴用移液器吸40 μL转移到96孔PCR板中，用封膜仪封口后，放在热循环PCR仪准备扩增。扩增条件同常规PCR反应条件。反应完成后，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过Quanta soft软件对结果进行分析。

1.5  菜豆晕疫病菌和对照菌株DNA的提取和制备

将菜豆晕疫病菌和对照菌株在NA培养基上28 ℃活化培养3 d后，刮取菜豆晕疫病菌和对照菌株，用无菌水制备成菌悬液，菌悬液在12 000 r/min离心5 min，弃上清，取沉淀，使用天隆DNA自动提取仪提取DNA，进行ddPCR检测。

1.6  带菌种子制备

以经检测确认未携带菜豆晕疫病菌的豌豆种子作为样品制备供试材料，使用前将种子置于烘箱中80 ℃烘干6 h。将试验需要的部分豌豆种子完全浸泡在 108 CFU/mL的菜豆晕疫病菌菌悬液中，于28 ℃、120 r/min振荡培养4 h，取出种子，在无菌环境下自然晾干5 d，获得携带菜豆晕疫病菌的豌豆种子。

1.7  PCR与ddPCR检测

1.7.1  引物特异性检测。

将“1.5”得到的菜豆晕疫病菌的DNA和对照菌株的DNA分别进行PCR、ddPCR检测。

1.7.2  PCR与ddPCR灵敏度检测。

将菜豆晕疫病菌的DNA按10倍系列进行稀释，然后按照菜豆晕疫病菌DNA原液（100）、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度进行PCR和ddPCR检测。

1.7.3  菜豆晕疫病菌活性检测。

将携带菜豆晕疫病菌的豌豆种子和健康种子分别按照粒数比1∶50、1∶80、1∶100混合后进行试验，每个比例设置3个重复。每份豌豆种子直接加至200 mL的NB培养基中振荡培养，按照2、4、6、8、10、12、14、24 h进行取样，每培养瓶每次取样500 μL，12 000 r/min离心后弃上清，取沉淀提取DNA后，进行ddPCR检测。

2  结果与分析

2.1  引物特异性验证  利用PCR与ddPCR反应扩增菜豆晕疫病菌和其他对照菌株（豌豆细菌性疫病菌、十字花科黑斑病菌、玉米细菌性枯萎病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种、菜豆细菌性萎蔫病菌、柑橘溃疡病菌、马铃薯青枯病菌、瓜类果斑病菌等14个菌株），结果见表2，除了目标菌株菜豆晕疫病菌，其他对照菌株均无扩增。菜豆晕疫病菌的PCR引物与ddPCR引物特异性强，能够区分其他对照菌株以及菜豆晕疫病菌近似种，具体结果见表2。菜豆晕疫病菌与对照菌株的ddPCR检测结果见图1。由图1可知，ddPCR检测只有菜豆晕疫病菌能够产生阳性微滴，对照菌株均不产生阳性微滴。

2.2  ddPCR的引物灵敏度  按10倍梯度稀释菜豆晕疫菌悬液，使用梯度稀释的菌悬液进行ddPCR检测，同时提取每一梯度的菌悬液DNA同步进行ddPCR检测。结果发现（表3），菜豆晕疫病菌的DNA在10-5稀释度时，检测拷贝数为0.6 copies/μL，与菌悬液在10-4稀释度下的单位拷贝数相同。同一梯度下的菜豆晕疫病菌菌悬液与其提取的DNA相比较，ddPCR对菜豆晕疫病菌DNA的检测灵敏度比菌悬液高1个数量级。相同浓度的菜豆晕疫病菌菌悬液与提取的DNA稀释后ddPCR微滴图见图2，菜豆晕疫病菌菌悬液在10-4稀释度时阳性微滴的单位拷贝数与菜豆晕疫病菌的DNA在10-5稀释度时阳性微滴的单位拷贝数相同，说明菜豆晕疫病菌DNA的检测灵敏度更高。