银杏内生菌及其次生代谢产物多样性和生防活性的研究进展
作者： 杨雨微 周向平 袁志辉 蔡芯兰 何福林 方俊
摘要 银杏是一种含有丰富内生菌和次生代谢产物的药用植物。近年来，国内外学者对银杏内生菌进行了较多的研究，从银杏的根、茎、叶、种子等部位分离出多种不同的内生菌，通过培养发酵、分离、纯化和鉴定，获得了多样化的次生代谢产物，如黄酮、萜类化合物等。这些化合物具有抗菌、抗氧化和抗病虫害等功能，在生物防治领域展现了良好的应用前景。综述了银杏内生菌及其次生代谢产物的多样性，并对其生物防治研究现状进行了总结，以期为银杏内生菌资源的开发利用提供参考。
关键词 银杏；内生菌；次生代谢产物；多样性；生物防治
中图分类号 Q 939 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）22-0020-09
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.003
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Endophytes of Ginkgo biloba and Its Secondary Metabolites Diversity and Biocontrol Activity
YANG Yu-wei ZHOU Xiang-ping3，YUAN Zhi-hui2，4 et al
（1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；2.College of Chemistry and Bioengineering，Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou，Hunan 425199；3.Yongzhou Company，Hunan Tobacco Company，Yongzhou，Hunan 425100；4.Hunan Provincial Engineering Research Center for Ginkgo biloba，Yongzhou，Hunan 425199）
Abstract Ginkgo biloba is a medicinal plant rich in endophytes and secondary metabolites. In recent years，scholars at home and abroad have conducted more research on Ginkgo biloba endophytes，isolated a variety of different endophytes from the roots，stems，leaves，seeds and other parts of Ginkgo biloba，and obtained a variety of secondary metabolites，such as flavonoids and terpenoids，through culture fermentation，separation，purification and identification. These compounds have antibacterial，antioxidant and anti-pest and disease functions，and show good application prospects in the field of biological control. In this paper，the diversity of endophytes and their secondary metabolites was reviewed，and the research status of their biological control was summarized，in order to provide a reference for the development and utilization of endophytes in Ginkgo biloba.
Key words Ginkgo biloba;Endophytic bacteria;Secondary metabolites;Diversity;Biological control
基金项目 湖南省烟草公司永州市公司科技项目（YZ2022KJ04）；湖南省教育厅科学研究项目重点项目（21A0519）；湖南省自然科学基金项目（2023JJ50070，2022JJ30272）。
作者简介 杨雨微（1999—），女，湖南岳阳人，硕士研究生，研究方向：生物工程、微生物资源的开发和利用。
*通信作者：方俊，教授，从事生物工程研究；何福林，教授，从事天然产物开发与利用研究。
植物内生菌（endophyte）是一类特殊的微生物，生活于植物组织、器官中，与植物共生，通常不会引起植物疾病，主要包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌［1］。在各种植物的不同部位，包括木本和草本植物、单子叶和双子叶植物［2］，都存在内生菌，这些内生菌在寄主植物生长和发育过程中起着重要的作用，包括帮助宿主植物吸收营养物质，保护宿主对抗病原体，免受病原菌的侵害，有助于植物在不同的环境中更好的生存等。内生菌是具有抗癌、抗菌和其他生物活性的次生代谢产物的重要来源。内生菌产生的次生代谢产物，为开发新的药用化合物提供了支撑，成为当前研究的热点［3］。如内生菌产生的黄酮、萜类等化合物，表现出抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗病虫害等生物活性，成为药物研发的潜在来源。同时，内生菌产生的次生代谢产物已经广泛应用于生物防治，包括微生物农药、增产菌或生防菌等领域［4］。 Selim等［5］对内生菌的次生代谢产物进行研究后指出，内生菌是生物活性次生代谢产物的重要来源，其产生的化合物可以广泛应用于生物医药、工农业等领域。
银杏（Ginkgo biloba L.）属落叶乔木，是一种古老的孑遗植物，其历史可追溯到2亿多年前，被誉为“活化石”，同时也是我国一级重点保护的珍稀树种。银杏对环境适应能力强，能够在不同类型的土壤和气候条件下生长，且自身具有很强的抗菌能力，使其在很长的寿命内几乎不会感染植物病虫害［6］，因此，银杏被广泛用作药用植物，其种子、叶子和果实可用于制作具有抗菌、抗氧化、抗病虫害、抗癌等生物活性的药物。这些药物具有良好的药理活性［7］，即使长时间使用也没有副作用，因此市场上对银杏的需求与日俱增。近年来，国内外研究者致力于优化银杏资源的开发，以实现更高效、更环保的利用。研究表明，银杏内生菌也具有类似的抗菌活性，且能够提高宿主在抗病、抗虫害和生长发育等方面的能力。从银杏的不同部位分离出的内生菌多样性非常丰富，其产生的次级代谢产物约50%对各种病原体具有抗菌活性。一些次生代谢产物，如2-己烯醛，参与了植物对害虫的防御［8］。基于此，笔者总结近年来关于银杏内生菌及其次生代谢产物的多样性和对植物病害的生物防治研究，以期为后续银杏内生菌资源的研究和挖掘提供参考。
1 银杏内生菌的多样性
银杏作为一种古老的植物，其内生菌种类繁多，广泛分布于其根、茎、叶、种子等不同组织部位，影响内生菌多样性的因素也很多［9］，如时间、温度、湿度等，能够进一步丰富银杏内生菌的多样性。
内生菌的多样性通常可以通过对银杏根系或土壤样本进行分析来评估。利用分子生物学技术，如高通量测序、原核微生物的16S rRNA、真菌的ITS、18S rRNA、还有DNA测序等，可以对内生菌进行鉴定和分类，从而研究其多样性和种类组成［10］。此外，通过观察银杏本身的生长和生长环境，也有助于研究其与内生菌的共生关系。
1.1 银杏内生真菌
银杏内生真菌能够在其生长过程中起着重要的作用，有效防止有害病原菌的入侵，保护宿主植物免受感染［9］。已发现的银杏内生真菌包括青霉菌属（Penicillium）、镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）、根霉属（Rhizopus）、枝孢属（Cladosporium）、毛壳菌属（Chaetomium）、曲霉菌属（Aspergillus）等，其多样性十分丰富［11］。如Wu等［12］从银杏叶、茎、根中一共分离出58株内生真菌，隶属于24个属，包括青霉菌属（Penicillium）、Cylindrocladiella属、Cylintrocarpon属、副磷球藻属（Paraphaeosphaeria）、Clonostachys属、Glionectria属、木霉属（Trichoderma）、丝霉属（Scytalidium）、钩球藻属（Leptosphaeria）、丛孢子虫属（Pleosporales）、副孔虫属（Paraphoma）、硬壳孢子虫属（Sclerostagnospora）、黑木耳属（Auricularia）、巴塔利尼亚属（Bartalinia）、褐藻属（Phaeoacremonium）、赤霉属（Bionectria）、链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属（Fusarium）、毛球藻属（Chaetosphaeronema）、枝孢属（Cladosporium）、拟茎属（Phomopsis）等。Cui等［13］从银杏根皮中分离出27株可培养的内生真菌，分属6个不同属，这些分离株在形态学上被鉴定为链格孢属（Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）、炭疽菌属（Colletotrichum）、镰刀菌属（Fusarium）、肉豆蔻属（Myrothecium）和青霉属（Penicillium），揭示了生活在银杏树内部的内生真菌的种类和数量。Qian 等［14］从银杏的根、茎、叶和树皮中共分离到57个真菌菌株，其中15个根分离株、34个茎分离株、1个叶分离株和7个树皮分离株。内生真菌包括链格孢属（Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）、Colletotrichum属、镰刀菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、Pestalotiopsis属、Phomosis属、Trichoderma属、木霉菌属（Trichoderma）和未鉴定菌株有亲缘关系。
1.2 银杏内生细菌
银杏根际内生细菌在植物的整个生长代谢过程中起着重要作用，能够促进植物生长、吸收土壤中的养分、并增强植物的抗性。然而，由于对银杏内生细菌的分离和培养方式的不同，导致银杏根际中的内生细菌多样性研究受到限制，因此，需要不断开发和改进新的研究方式，以便获得更多有关内生细菌的信息［15-16］。Zhang等［17］从银杏根际中成功分离了455株内生细菌，其中320个来自根内圈，135个来自根际。基于16S rRNA基因序列分析，确定细菌分离株的多样性，涵盖了放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形杆菌门（Proteobacteria）和热球菌门（Deinococcus-Thermus）等8个门、20个类、42个目、67个科和38个属。收集最多的是6个属，分别是芽孢杆菌（Bacillus）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、链霉菌（Streptomyces）、黄杆菌（Flavobacterium）、根瘤菌（Rhizobium）和微杆菌（Microbacterium）。此外，银杏根际还可能存在来自不同属的其他物种，其中大多数物种来自芽孢杆菌属（Bacillus）。从根内圈（35属）和根际（16属）培养的内生细菌属种更为丰富，包括红球菌属（Rhodococcus）、微杆菌属（Microbacillus）、Cocuria属、链霉菌属（Streptomyces）、Deinococcus属、孢杆菌属（Bacillus）、赖西尼芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、帕尼芽孢杆菌属（Panibacillus）、Cohnella属、根瘤菌属等，这些细菌在根际和根内层之间共存。 Islam等［18］从银杏树的果实和叶片中分离出50个内生细菌，银杏叶中有11个分离株，银杏果实中有39个分离株。分别来自不同的培养基，如LB培养基中有30个分离株、YNA培养基中有19个分离株、MRS培养基中有1个分离株。这些内生细菌的形态多样，呈现出圆形或不规则的细胞，菌落的颜色也各异，包括白色、米白色、透明、棕色、浅棕色、浅黄色、黄色或橙色，菌落边缘呈现粗糙或波状。这些数据充分证明了银杏根际内生细菌的丰富多样性。