新型植物免疫激活蛋白维大力（VDAL）对烟草花叶病毒抑制作用

摘要  ［目的］明确新型植物免疫激活蛋白维大力（VDAL）对烟草花叶病毒（TMV）的抑制作用。［方法］采用半叶枯斑法和分光光度法，分别测定植物免疫激活蛋白VDAL对TMV的抑制作用和烟草植株过氧化物酶（POD）活性的影响。［结果］VDAL对TMV具有较好的体外钝化作用，当钝化时间为90 min时，枯斑抑制率可达到80.76%；喷药3次后抑制率为85.04%，且过氧化物酶活性较对照增加了1.26倍。［结论］VDAL可能通过对病毒的钝化作用并诱导烟草植株产生防御反应，进而防治烟草花叶病毒病。

关键词 烟草花叶病毒；维大力；半叶枯斑法；分光光度法；过氧化物酶

中图分类号 S 435.72  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）22-0140-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.029

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Inhibitory Effect of Novel Plant Immune Activating Protein VDAL on Tobacco Mosaic Virus

HEI Ya-ya1， LI Yong-liang2， GUO Lin-lin1 et al

（Yangling Xiang Lin Agricultural and Biotechnology Science Co.， Ltd.， Yangling， Shaanxi 712100;2. Tobacco Company of Baoshan City Yunnan Province， Baoshan， Yunnan 678000）

Abstract ［Objective］ To clarify the inhibitory effect of a new plant immune activating protein （VDAL） on tobacco mosaic virus （TMV）. ［Method］ The inhibition of plant immune activating protein （VDAL） on TMV and the effect on peroxidase （POD） activity in tobacco plants were determined by spot inhibition and spectrophotometry. ［Result］ VDAL had a good inactivation effect on TMV in vitro. When the inactivation time was 90 min， the inhibition rate of lesions could reach 80.76%. After three times of spraying， the inhibition rate could rise to 85.04%， and the peroxidase activity increased 1.26 times compared with the control. ［Conclusion］ VDAL may control TMV disease by inactivating the virus and inducing the defense response of tobacco plants.

Key words Tobacco mosaic virus;VDAL;Half-leaf spot method;Spectrophotometry;Peroxidase

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是世界上第一个被发现的植物病毒，能够侵染400多种植物，有着非常广泛的寄主范围^［1］。由TMV侵染引起的烟草花叶病毒病广泛分布于世界各地，其田间发病率极高，严重时可达100%，由于TMV在植物细胞中绝对寄生，难以防治，被称为“植物癌症”^［2］。感染TMV后的烟草品质和产量均会下降，严重时甚至颗粒无收，给种植烟草的农户和企业等带来巨大的经济损失^［3］。由于化学防治方法有着高效、经济、快速等优点，所以在生产中人们常常选择用化学药剂防治烟草花叶病毒病，但是长期大量以及不规范使用化学农药，很容易引起环境污染、农药残留以及抗药性等问题，不利于我国烟草产业的绿色可持续发展。因此，如何避免防治防治烟草病毒病过程中化学农药不合理使用已经成为生产中亟待解决的问题^［4］。

植物免疫诱抗剂是指利用来源于生物活体或其代谢产物的某种物质诱导植物体产生抗性的一种新型生物农药，包括蛋白多肽类、有机酸类、寡糖类和无机化合物类等^［5-6］。植物免疫激活蛋白作为植物免疫诱抗剂的一种，在植物受到外界环境或者病原菌等不利因素的影响时，能够诱导植物产生各种免疫防御反应，促进植物对营养物质、水分等的吸收，增强植株的抗病能力，进而使植物更加健康地生长，提高作物的产量和品质，同时也能够降低化学农药和肥料的使用量，符合农业绿色和可持续发展的要求，已经成为农药开发应用的热点之一^［7-10］。维大力（VDAL）是一种新型的植物免疫激活蛋白，来源于棉花黄萎菌，它不仅可以调节植物体内的多种生长代谢活动，促进作物的生长发育，改善农产品品质，增加产量和收入，还可以激活和诱导植物对各种病虫害的抗性^［11］。近年来国内已经有VDAL相关产品促产增收、抗病虫害等相关报道。马全伟等^［12］研究发现，VDAL可以提高生菜的产量与品质。李刚等^［13］研究发现，VDAL和蓟马信息素黏虫板共同使用可以减轻蓟马对芒果的危害。张动军等^［14］研究发现，施用VDAL不仅能提高小麦的抗逆能力，还能促进其增产增收。此外，还有一些研究表明，VDAL可以提高马铃薯、葡萄等作物的品质，并一定程度提高作物的抗病性^［15-17］。有关VDAL在烟草上的应用研究少见报道。

过氧化物酶（POD）作为一种氧化还原酶与植物体内的多种生理生化反应都相关，它除了能够催化酚类物质的氧化反应过程和促使木质素的聚合外，还能降低活性氧的含量，避免因其浓度过高而破坏细胞膜^［18］。Morkunas等^［19］研究表明过氧化物酶是植物体为了抵御病原菌的侵染，形成防御系统的重要因素之一。目前有很多研究也已经把过氧化物酶活性变化作为植物抗病性鉴定的一项指标。周东兴等^［20］研究发现，贝莱斯芽孢杆菌可以诱导番茄植株产生更多的POD、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御酶，进而提高其对枯萎病的防效。还有研究表明，一种新型植物源杀菌剂苯丙烯菌酮微乳剂，在质量浓度为40 mg/L时对TMV的防效为75%，且能显著提高植株防御酶活性^［21］。彭海莹等^［22］研究报道，将2种生防真菌的发酵液与氨基寡糖素共同使用，可以促进烟草幼苗的生长和烟草体内的各种防御酶活性的提高，从而更好地防治烟草黑胫病和根黑腐病。

为明确植物免疫激活蛋白VDAL对烟草花叶病毒病是否具有较好的诱导防治效果，该研究以烟草为试验材料，测定施用VDAL对TMV的体外钝化作用、诱导抗病性以及烟草植株POD活性的影响，旨在为VDAL在烟草生产中的合理推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物。心叶烟，为TMV枯斑寄主。

1.1.2 供试病毒。TMV由西北农林科技大学植物保护学院提供。

1.1.3 供试药剂。VDAL新型植物免疫激活蛋白干粉（含2% VDAL蛋白），由杨凌翔林农业生物有限公司生产提供；抗病毒剂A（含3%氨基寡糖素），由河北中保绿农作物科技有限公司生产提供。

1.2 方法

1.2.1 烟草育苗。将烟草种子均匀洒在装有基质的育苗盘上，并覆盖适量基质，将育苗盘放入气候室［温度（26±1）℃，光照12 h/d，湿度60%］培养，20 d后移栽至花盆（高9.5 cm，直径11.0 cm）中，待幼苗长至5～8叶时备用。

1.2.2 病毒接种。 选择心叶烟上部最新长出且展开的叶片采用摩擦接种法接种TMV（质量浓度为20 μg/mL）：先在接种的叶片表面洒少许粒径为37 μm的金刚砂，再用毛笔蘸取适量TMV溶液均匀涂抹于叶片表面，并于接种8 min后用清水冲洗。

1.2.3 VDAL对TMV的体外钝化作用。采用半叶枯斑法^［23］进行钝化试验：挑选健康且长势一致的5～6叶期心叶烟，将VDAL稀释7 500倍与TMV等体积混合后分别钝化30、60和90 min，摩擦接种于左半边叶片（处理）；抗病毒剂A稀释400倍与TMV等体积混合分别钝化30、60和90 min后，摩擦接种于左半边叶片（药剂对照）；无菌水与TMV等体积混合后分别钝化30、60和90 min，摩擦接种于右半边叶片（CK1为VDAL空白对照，CK2为抗病素剂A空白对照），每个处理接种3个叶片，重复3次，并在3 d后统计枯斑数，计算枯斑抑制率。计算公式如下：

枯斑抑制率（%）=（对照枯斑数-处理枯斑数）对照枯斑数×100（1）

1.2.4 VDAL诱导烟草抗TMV活性测定。

采用罗琰^［24］的方法并加以改进。选择健康、长势一致的5～6叶期心叶烟，共设置3个处理：清水（空白对照CK）、抗病毒剂A 400倍稀释液（药剂对照）以及VDAL 7 500倍稀释液，每隔5 d喷施1次药液，总共喷3次，在每次喷完药24 h后进行TMV摩擦接种。每个处理接种3个叶片，设置3次重复，并于接种3 d后统计枯斑数，根据公式（1）计算枯斑抑制率。

1.2.5 烟草植株防御酶活性测定。

选择健康、长势一致的8～10叶期心叶烟，设置对照（空白对照CK）、抗病毒剂A 400倍稀释液（药剂对照）和VDAL 7 500倍稀释液，共3个处理。共施药2次，每次间隔5 d，分别在第1次施药后的第 0、1、3、5、7、9天剪取同一叶位的烟草叶片，每个处理随机选取3株，重复3次，液氮速冻后在-80 ℃冰箱保存待测定POD活性，测定方法参照刘偲嘉^［25］。

1.3 数据处理

采用SPSS软件及Excel进行数据统计分析与制图。

2 结果与分析

2.1 VDAL对TMV的体外钝化作用

从表1可以看出，VDAL与抗病毒剂A对TMV都具有一定的钝化作用，其中VDAL处理组的钝化效果随着钝化时间的延长逐渐提高，当钝化时间为90 min时，抑制率高达80.76%，而抗病毒剂A处理组的抑制率在31.14%～34.44%。通过分析可知，相同处理的不同钝化时间的抑制率之间无显著差异，而在相同的钝化时间内，VDAL处理组的抑制率均显著高于抗病毒剂A处理组，可见VDAL对TMV体外钝化效果明显。

2.2 VDAL诱导烟草抗TMV活性

由表2可知，随着喷药次数的增加，VDAL和抗病毒剂A对TMV的诱导效果均越来越好，其中在累计施药1次和2次后，VDAL处理组的烟草叶片枯斑数均显著少于抗病毒剂A处理组和CK处理组，且在只喷施1次VDAL后，枯斑抑制率就已经达到了46.99%，而在累计喷施3次后抑制率增加到85.04%，高于抗病毒剂A处理（80.55%），但没有表现出明显的差异性。可见VDAL能够诱导烟草产生抗TMV活性，且在一定范围内增加施药次数可以提高烟草植株的抗病能力，从而更有效地防治烟草花叶病毒病。