活性炭对极大节旋藻来源藻蓝蛋白和蛋白质的吸附性能和机制研究

摘要 通过等温吸附、吸附动力学和吸附热力学试验，揭示活性炭对C-PC和总蛋白质的吸附特性和作用机制。结果显示：同样条件下，活性炭去除杂蛋白质的效率更高，经过活性炭纯化后，C-PC占总蛋白质的比例从31.2%增加到51.5%；活性炭对C-PC和总蛋白质的最大吸附量分别为10.5和88.5 mg/g；活性炭对C-PC的吸附为单分子层化学吸附，符合Langmuir等温吸附模型，而对总蛋白质的吸附为多层级的吸附，符合Freundlich等温线模型。

关键词 螺旋藻；藻蓝蛋白；蛋白质提取；活性炭；吸附等温曲线

中图分类号 Q 946  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）23-0001-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.001

Study on Adsorption Capacity and Mechanism of Activated Charcoal on Arthrospira maxima-derived C-phycocyanin and Proteins

BAI Ren-ao

（College of Building and Ecology， Shantou Polytechnic， Shantou， Guangdong 515078）

Abstract The isotherms， adsorption kinetics， and thermodynamics analyses were employed to elucidate the adsorption properties and mechanisms of action of activated charcoal on C-PC and total proteins. The results revealed that： under the same conditions， activated charcoal was more efficient in removing heteroproteins， and after purification with activated charcoal， the proportion of C-PC to the total protein increased from 31.2% to 51.5%;the maximum adsorption of C-PC and total protein by activated charcoal was 10.5 mg/g and 88.5 mg/g， respectively;the adsorption of C-PC by activated charcoal was a monomolecular layer chemisorption， consistent with the Langmuir isothermal adsorption model， whereas the adsorption of total proteins of activated charcoal was a multilayer adsorption， consistent with the Freundlich isotherm model.

Key words Spirulina;C-phycocyanin（C-PC）;Protein extraction;Activated charcoal;Adsorption isotherm models

基金项目 广东省高校特色创新项目（自然科学）（2023KTSCX332）；汕头职业技术学院第二批高层次人才科研启动基金项目（SZK2022G18）。

作者简介 白仁奥（1985—），男，湖北随州人，博士，从事藻类产品生物炼制技术研究。

收稿日期 2024-07-08

藻蓝蛋白（C-phycocyanin，C-PC）是蓝藻（cyanobacteria）、红藻（rhodophytes）、隐藻（cryptophytes）和灰胞藻（glaucocystophytes）中最具价值的水溶性蛋白质之一。C-PC是一种藻胆蛋白，是天然、稳定的蓝色色素-蛋白质复合物，有抗氧化、抗炎、神经保护和肝脏保护的功效［1］。不同行业对C-PC的纯度要求不同，在医药行业，C-PC纯度（A620/A280）应大于4.0；在科研领域，C-PC纯度要求在2.5～3.5；在食品和化妆品领域，C-PC纯度需要大于2.0［2］。

纯化C-PC常用的方法有硫酸铵沉淀法，在这一过程中，50%～60%（w/v）硫酸铵被用于沉淀C-PC，随后进行离心分离、中和和脱盐处理［3］，这一工艺通常耗时，且消耗大量淡水资源，存在生产成本高及环境不可持续的问题。超滤也是工业生产中较为常用的纯化C-PC的方法之一［2，4-6］，尽管超滤法是一种环境友好且可放大的工艺，但是膜污染会降低膜通量，增加处理时间。此外，较低的选择性导致在纯化C-PC过程中不能较显著地提高其纯度［7-8］，这些缺陷限制了超滤法在纯化C-PC过程中的广泛应用。最后，双水相法也是一种较为成熟的纯化蛋白质或者酶的技术，许多研究利用这一方法从螺旋藻中纯化C-PC［9-10］。与其他分离技术相比较，双水相技术具有很多优点，如易放大和提高生物质载量，但是形成相组分的高成本和对于目的蛋白质的低选择性阻碍其在工业规模上的广泛应用［11-12］。

考虑到目前大规模制备高纯度C-PC存在的问题，笔者在已有研究的基础上，将超声破壁、调节浆料pH（pH-shift）和活性炭纯化相结合的方式，制备高纯度C-PC，重点对活性炭纯化C-PC的吸附性能和作用机制进行了研究，以期为后续开发更高效和更具成本优势的纯化材料奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

极大节旋藻（Arthrospira maxima）购自福清市新大泽螺旋藻有限公司；活性炭、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、冰醋酸和氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白质测定试剂盒购自（TP0300-1KT）Sigma-Aldrich；商品化C-PC购自浙江宾美生物科技有限公司；预染彩色蛋白质Marker购自碧云天生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Vibro-Cell/VC750超声破壁机，配备25 mm超声探头，美国超声与材料股份有限公司；Eppendorf-5415D高速冷冻离心机；伯乐Bio-Rad Gel Doc EZ凝胶成像仪，伯乐生命医学产品有限公司；EL104型分析天平，梅特勒-托利多有限公司；PiLot3-6E型真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Vortex Genie2T涡旋混匀仪，美国科学产业股份有限公司；紫外-可见分光光度计UV-2450，日本岛津仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 极大节旋藻藻蓝蛋白粗提液制备。

极大节旋藻藻蓝蛋白粗提液采用文献［13］中的方法。极大节旋藻和Milli-Q水按照20 mL/g干生物质的比例进行混合，超声功率为750 W，频率为20 Hz，超声探头直径为25 mm，超声振幅为80%，超声时间为16 min，脉冲是5 s开和5 s关，超声过程中采用冰浴方式控制样品温度，超声后所得浆料，立即用0.5 mol/L醋酸水溶液将浆料pH分别调至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5，随后2 500 g和4 ℃条件下离心30 min，收集的上清液即为极大节旋藻粗提液。

1.3.2 活性炭纯化藻蓝蛋白粗提液。

上一步所得粗提液，加入不同浓度活性炭，如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%（w/v），溶液在不同转速（200、400、600、800、1 000、1 200和1 400 r/min）条件下混匀不同时间（2、4、6、8、10和12 min），所有操作在室温（25 ℃）条件下进行。处理后的样品溶液通过20 000 g离心30 min，收集上清液，上清液中C-PC的浓度、纯度和回收率通过测定样品在280、620和650 nm条件下的吸光值并按照“1.3.4”中的方程式（1）、（2）和（3）计算。

1.3.3 蛋白质含量测定。

蛋白质含量用商业化试剂盒（TP0300-1KT）的Lowry法进行测定［14］。测定过程：200 μL经过适当稀释的样品溶液和200 μL的Lowry试剂溶液（试剂盒提供）混匀（1.5 mL离心管进行）并简短离心后，室温条件（25 ℃）避光放置 20 min，然后加入100 μL福林酚试剂，混匀并简短离心后，室温避光孵育30 min，将100 μL反应液移入96孔板（LOT-31018020）中，测定560 nm处的吸光值，每个样品3个平行样，BSA作为标准蛋白质样品绘制标准曲线。

1.3.4 测定C-PC含量和纯度。

液氮研磨用于测定原材料极大节旋藻中总C-PC的含量［15］。将100 mg极大节旋藻干粉放入研钵中，加入2 mL磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH 7.0），充分混匀后缓慢加入液氮，待凝固后充分研磨，液氮挥发完毕后，再加入同样量的液氮，继续研磨，这一过程至少重复2次。研磨后的浆料转入2 mL离心管，16 000 g和4 ℃条件下，离心30 min，上清液转入一个新的15 mL离心管，4 ℃储存用于测定C-PC含量。残渣中再加入2 mL磷酸盐缓冲液，重复上述液氮研磨的过程，这一过程至少重复3次，确保原材料中C-PC得到充分回收。最后将所有上清液收集在一起，测定上清液中C-PC的含量，C-PC的纯度和含量按照下式进行计算［16-18］：

C-PC浓度（mg/mL）=（A620-0.474×A650）/5.34（1）

C-PC纯度（Purity）= A620A280（2）

C-PC回收率（Yield）（%）=C2×V2C1×V1（3）

式（3）中：C2和V2分别是C-PC的浓度和样品体积，C1和V1分别是上一步中C-PC的浓度和体积。

1.3.5 等温吸附模型。

所有试验的混匀过程都在15 mL离心管中、室温条件（25 ℃）和200 r/min转速条件下进行。第1步是确定接触时间和吸附平衡时间的影响，0.18 g活性炭和4 mL在pH 5.0条件下收集的上清液混合后，在室温条件混匀0.5～24 h。第2步是确定上清液中起始C-PC浓度和总蛋白质浓度对吸附的影响，pH 5.0条件下收集的上清液分别稀释2、4、6、8和10倍，每4 mL样品溶液加入0.18 g活性炭，200 r/min转速条件下混匀12 h。第3步是研究活性炭的用量对吸附行为的影响，0.09、0.18、0.27、0.36、0.45和0.54 g活性炭分别与4 mL经过10倍稀释的上清液混合，200 r/min转速下混匀24 h。所有样品处理完毕后，20 000 g和4 ℃条件下离心30 min，收集上清液，按照方法“1.3.3”和“1.3.4”分别测定总蛋白质和C-PC含量。

1.3.6 测定吸附能力和计算去除百分比。

与动力学相关参数按照以下方程进行计算：

A（%）=（C0-Ce）×100/C0

qt=（C0-Ct）×V/m

qe=（C0-Ce）×V/m

式中：A（%）、C0（mg/L）、Ct（mg/L）、 Ce（mg/L）、 V（L）、 qt（mg/g）、qe（mg/g）和 m（g）分别为清除率（清除百分比）、被吸附溶质的起始浓度、被吸附溶质在时间t时的浓度、被吸附溶质的终/平衡浓度、样品体积、活性炭在时间t的吸附能力、活性炭在平衡状态时的吸附能力和活性炭的质量。