嗜水气单胞菌Hcp蛋白的原核表达•多克隆抗体制备及生物信息学分析

摘要 ［目的］获得嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）Hcp蛋白的多克隆抗体（Polyclonal Antibody）及基本生物学特性。［方法］利用RT-PCR方法扩增Hcp基因，构建重组表达质粒后转化BL21感受态细胞，经IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside）诱导表达获得Hcp重组蛋白，纯化后免疫家兔，制备针对该蛋白的多克隆抗体，进行抗体的效价测定、Western blotting鉴定，利用生物信息学在线工具对其基本理化性质、保守结构域、磷酸化位点、二级与三级结构进行预测。［结果］该蛋白在IPTG 终浓度为 0.6 mmol/L、37 ℃下诱导表达6 h可获得最高表达量，蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在；Western blotting结果显示，AH的培养物上清与沉淀均能够与制备的兔抗发生特异性结合，具有良好的反应原性，制备的多克隆抗体效价达1.024×106。生物信息学分析表明，嗜水气单胞菌Hcp蛋白的分子式为C846H1304N224O259S8，共编码172个氨基酸，相对分子质量为19 013.49 u，等电点（PL）为5.24，属于稳定蛋白；二级结构中无规则卷曲占比为 51.74%，延伸链占比为25.00%，α-螺旋占比为19.19%，β-转角占比为4.07%。［结论］成功制备了Hcp蛋白的多克隆抗体，为进一步研究AH的VI 型分泌系统（Type VI secretion system，T6SS）提供技术支持。

关键词 嗜水气单胞菌；Hcp基因；原核表达；多克隆抗体制备；生物信息学

中图分类号 S 94  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）23-0079-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.018

Prokaryotic Expression of Hcp Protein of Aeromonas hydrophila，Preparation of Polyclonal Antibody and Bioinformatics Analysis

XU Yi-lan1，XU Jia-le2，LU Bing-xia1 et al

（1.Guangxi Veterinary Research Institute/Key Laboratory of Veterinary Biotechnology of Guangxi，Nanning，Guangxi 530002;2.Animal Science and Technology College，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005）

Abstract ［Objective］In order to obtain a polyclonal antibody to the Hcp protein of Aeromonas hydrophila （AH） and its basic biological properties.［Method］The present study utilized RT-PCR to amplify the Hcp gene，constructed a recombinant expression plasmid and then transformed the BL21 receptor cells，which were induced to express the Hcp recombinant protein through IPTG （Isopropyl β-D-Thiogalactoside），purified and immunized rabbits，and then prepared a polyclonal antibody against the protein.Hcp recombinant protein was obtained by IPTG （Isopropyl β-D-Thiogalactoside） induced expression，purified and immunized rabbits，and polyclonal antibody against the protein was prepared，and the potency of the antibody was determined，identified by Western blotting，and its basic physicochemical properties，conserved structural domains，and phosphorylation sites were investigated using bioinformatics online tools，secondary and tertiary structure prediction.［Result］The results showed that the highest expression of the protein was obtained at the final concentration of IPTG of 0.6 mmol/L at 37 ℃ for 6 h，and the protein mainly existed in the form of soluble protein; the results of Western blotting showed that the supernatant and precipitate of the culture of AH were able to specifically bind to the prepared rabbit antibody with good reactivity，and the potency of the prepared polyclonal antibody reached 1.024×106.Bioinformatics analysis showed that the molecular formula of Aeromonas hydrophila Hcp protein was C846H1304N224O259S8，encoding a total of 172 amino acids，with a relative molecular mass of 19 013.49 u，an isoelectric point （pl） of 5.24，which is a stabilized protein; the secondary structure of the protein was 51.74% of the irregularly coiled，25.00% of the elongated chain，and 25.00% of the alpha-chain.25.00%，α-helix accounted for 19.19%，and β-turns accounted for 4.07%.［Conclusion］In this study，a polyclonal antibody to Hcp protein was successfully prepared，which can provide technical support for the further study of Type VI secretion system （T6SS） of AH.

Key words Aeromonas hydrophila;Hcp gene;Prokaryotic expression;Preparation of polyclonal antibody;Bioinformatics

基金项目 广西重点研发计划项目（桂科AB21076008，桂科AB20297059）；玉林市科学研究与技术开发计划项目（玉市科20220519）。

作者简介 许艺兰（1996—），女，广西北流人，研究实习员，硕士，从事动物病原学研究。*通信作者：陈忠伟，正高级兽医师，从事动物病毒学研究；何颖，正高级兽医师，博士，从事兽医药理学和动物传染病学研究。

收稿日期 2024-01-15

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）是革兰氏阴性菌、弧菌科气单胞菌属，是一种普遍存在于各种水体、土壤中的条件性病原菌［1］，是构成养殖水环境中正常菌群种类之一，能够引起鱼类、动物和人的多种疾病［2］，如可诱发鱼类感染败血症［3］，为国内外水产养殖业带来巨大的经济损失［4-5］。目前在水产养殖业中主要依靠抗生素抑制AH感染［6］，抗生素的滥用不仅会导致AH产生耐药性，还对生态环境与食品安全质量产生影响［7］，引起食品质量安全问题和生态安全问题［8］。水产养殖中水生生物易受到AH的侵袭而产生疾病。虾的个体较小，逐一进行治疗不现实，而虾群在水体中也难以治疗。因此，控制该细菌在人群和水产养殖中的不断暴发具有重要意义［9］。

AH的致病机制十分复杂，使宿主的疾病发生通常依靠分泌系统与毒力因子之间的相互作用。IV型分泌系统（type VI secretion system，T6SS）是AH的分泌系统之一［10］，由13个蛋白组成，负责将部分效应蛋白运传递到细胞外。溶血素共调节蛋白（hemolysin co-regulated protein，Hcp）是T6SS的蛋白质成分之一， Hcp蛋白可以形成一个类似管状的六聚体，协助T6SS分泌毒力相关蛋白［11-12］。Hcp蛋白在T6SS系统中起着重要作用，既是其结构蛋白帮助形成注射装置分泌蛋白，又是其效应蛋白可以分泌到胞外增强毒力［13］。笔者制备兔抗Hcp多克隆抗体，为深入开展Hcp的相关研究提供研究工具，还通过生物信息学软件分析其基本理化性质、结构等，为后续致病机制探究提供理论信息。

1 材料与方法

1.1 菌株及载体  AH-SC-3株、pET-32a（+）载体由广西兽医生物技术重点实验室保存并提供。DH5α、BL21（DE3） 感受态细胞购自上海昂羽生物技术有限公司。

1.2 主要试剂和仪器

限制性内切酶EcoRI和Xho I、T4 DNA Ligase购自宝日医生物技术（北京）有限公司；质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司；His标签蛋白纯化试剂盒、山羊抗兔IgG（H+L）HRP抗体购自康为生物技术有限公司；预染蛋白Marker购自GenStar公司。

1.3 引物的设计与合成

根据Hcp基因序列设计Hcp基因特异性引物，限制性酶切位点分别为EcoRI和Xho I。Hcp-F：5′—3′：CCGGAATTCATGCCAACTCCATGTTATAT； Hcp-R：5′—3′： CGGCTCGAGTTACGCCTCGATCGGAGCAC。

1.4 Hcp基因的扩增

以AH-SC-3的DNA为模板， Hcp-F/R为引物对进行PCR扩增，按照胶回收试剂盒操作说明对PCR产物进行胶回收。

1.5 原核表达质粒pET-32a-Hcp的构建

对目的基因Hcp的胶回收产物和pET-32a（+）载体进行双酶切，再次胶回收，按照T4连接酶说明书对2个片段进行连接，将连接产物按照DH5α感受态细胞使用说明转化至DH5α感受态细胞。次日将单菌落扩繁后按照质粒抽提试剂盒操作说明提取质粒。对获得的质粒进行酶切鉴定并测序，命名为pET-32a-Hcp。

1.6 重组Hcp蛋白的诱导表达及表达条件的优化

按照说明书将pET-32a-Hcp转化至BL21感受态细胞涂布于含氨苄抗性的LA平板，37 ℃恒温培养箱培养12 h。挑取单菌落于37 ℃ 150 r/min培养6 h，取部分菌液进行PCR鉴定，对鉴定正确的阳性克隆进行增菌培养。达到对数生长期后通过加入不同剂量的IPTG和改变诱导时间来确定最佳诱导条件。收集菌液8 000 r/min 3 min弃上清，加入40 μL PBS重悬沉淀，并与10 μL×loading buffer混合，沸水浴10 min后进行SDS-PAGE电泳。

1.7 重组Hcp蛋白表达形式的鉴定及纯化

将表达的菌液进行超声裂解，裂解产物4 000 r/min 10 min分离上清和沉淀，将沉淀溶解于Inclusion Body Elutio Buffer。将40 μL的上清与沉淀溶解液与10 μL×loading buffer混合，沸水浴10 min后进行SDS-PAGE电泳。确定表达形式后进行大量诱导。根据纯化试剂盒中的方法纯化蛋白。

1.8 重组Hcp蛋白多克隆抗体的制备

按照表1所示的免疫程序，对家兔皮下进行多点注射。免疫结束后第7天进行心脏采血，收集血清（免疫前从兔耳缘静脉采血，分离血清作为阴性对照）。

1.9 兔抗Hcp蛋白多克隆抗体效价的测定 测定方法参考文献［14］。

1.10 兔抗Hcp蛋白多克隆抗体反应性的测定

收集27 ℃、150 r/min过夜培养的嗜水气单胞培养物，分别以培养物上清与沉淀作为抗原，以1∶4 000稀释的兔阳性血清和阴性血清为一抗，以1∶10 000稀释的HRP山羊抗兔IgG（H+L）为二抗进行Western blotting，以判断该抗体的反应性。