罗丹明B在3种作物中传导能力研究

摘要 研究罗丹明B荧光示踪剂在大豆、玉米、烟草幼苗上的传导能力。结果表明经水培处理的植株幼苗地上部均能检测到罗丹明B，其中大豆幼苗真叶部含量较高，玉米幼苗叶鞘中含量高于叶，烟草幼苗茎中含量高于叶。经罗丹明B处理后的植株鲜重与未处理之间无显著差异。同时以烟草幼苗作为模式作物，借助活体成像技术发现叶片和茎分别经质量浓度为15 mg/L和30 mg/L罗丹明B处理后的荧光强度最高。

关键词 罗丹明B；植物传导；活体荧光成像

中图分类号 S 45  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）23-0140-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.029

Study on the Conductivity of Rhodamine B in Three Plants

WEI Hong， LI Meng， WANG Zhen et al

（College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agriculture University， Hohhot， Inner Mongolia 010019）

Abstract In this work， the Rhodamine B was selected as fluorescent tracer to investigate its conductivity on soybean， maize and tobacco seedlings. The results suggested that Rhodamine B could be detected in the aboveground parts of hydroponic treated plant seedlings， therein， soybean seedlings had the highest content in part of true leaves， the leaf sheath of maize seedlings had a higher content compared with leaves， and tobacco seedlings had a higher content in the stem than leaves. There was no significant difference in fresh weight between Rhodamine B treated plants and untreated plants. And choosing tobacco seedlings as the model crop， the fluorescence intensity was dedected by in vivo imaging system. The results showed that the fluorescence intensity was the highest in leaves and stems with treat concentrations of 15 mg/L and 30 mg/L， respectively.

Key words Rhodamine B;Plant transmission;In vivo fluorescence imaging

基金项目 内蒙古自治区自然科学基金项目（2022MS03030）；内蒙古农业大学青年教师科研能力提升专项（BR220130）；内蒙古农业大学园艺与植物保护学院中青年教师科研能力提升专项（BR230101）。

作者简介 魏宏（1998—），女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向：资源利用与植物保护。

*通信作者：王振，讲师，博士，从事绿色农药制剂研发；赵明敏，教授，博士，从事植物病毒学研究。

收稿日期 2024-02-12；修回日期 2024-03-19

杂草通过与作物竞争阳光、水分、空气、营养物质等资源的方式，极大地影响了作物的生长，如何减轻杂草危害是当前农业生产中面临的重要问题。精准的除草技术，可以减少化学药剂使用［1］，符合绿色植保的发展需求，有利于我国农业可持续发展。

快速准确识别杂草，是农田杂草精确管理的基础。随着计算机技术、网络技术以及视觉技术的发展，快速精准的机器视觉技术在杂草识别上的应用越来越广泛，该技术显著提高了除草机械的作业能力，为精准除草提供了技术保证［2］。基于机器视觉技术的杂草识别技术是通过深度学习以及构建作物和杂草颜色、纹理、形态等特征数据库的方式，实现杂草有效识别［3-4］。该技术在传统图像处理的基础上，通过结合 MATLAB 图像处理技术［5］、视觉注意模型［6］、图像处理多算法融合［7］以及高度特征与单目图像特征融合的 SVM 识别模型［8］等方式极大地提高了识别杂草的能力。

然而在实际应用中，自然环境变化会影响图像采集质量；部分杂草与作物形态相似，加大了自动识别的难度；并且杂草的形态特征随生长周期变化较大，增加了机器学习的工作量，不利于实践操作；此外，一些识别模式对硬件资源要求较高［9］，难以推广应用。

作物植株信号技术是一种本质为荧光示踪技术的新型机器-植物互作技术，该技术通过对标记荧光示踪剂的作物进行靶向识别，从而区分作物与杂草［10-11］。与基于计算机学习算法的视觉技术相比，作物植株信号技术具有操作简便、识别准确的优点。

随着现代生物学技术的发展，新型荧光标记物质被不断发现，各种先进荧光检测技术和仪器被发明应用，荧光标记技术作为一种非放射性的标记技术开始受到重视和发展并在生物学、工业［12］、医药研究［13］、环境勘探［14］等领域广泛应用。

示踪剂的荧光特性及其在作物体内的传导能力是影响荧光示踪效果的关键因素［13］。罗丹明染料是以氧杂蒽为母体的碱性呫吨染料，其中，罗丹明B（Rh-B）因其光稳定性强、荧光产量高、波长范围宽、pH敏感性低、细胞膜渗透性良好以及对细胞无毒副作用等优点，常被用作植物活体细胞荧光示踪剂［15-16］。

该试验选取Rh-B作为示踪剂，研究大豆、玉米和烟草根系对其吸收及其在作物内向上传导能力，以期开发一种新型精准识别杂草的技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品和仪器。乙腈（色谱纯）购于默克公司；甲酸（色谱纯，≥98%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Rh-B标准品（HPLC 级，＞99%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；霍格兰氏营养液购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

高效液相色谱仪（安捷伦1260 Infinity II）；立体式荧光显微镜（LEICA M205 FA）；植物活体成像系统（IVScope 7200）。

1.1.2 供试作物和基质。

大豆（合丰55）由黑龙江省农业科学院合江农业科学研究所提供；玉米（先玉335）购于铁岭先锋种子研究有限公司；本氏烟为内蒙古农业大学植物病毒实验室自留；基质购自内蒙古蒙肥生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 作物幼苗培养。在直径 15 cm的花盆中加入基质播种大豆、玉米和烟草，并分别培养至大豆真叶完全舒展、玉米第1片叶与叶鞘垂直、烟草八叶期。

向霍格兰氏营养液中加入Rh-B，配制成质量浓度为60 mg/L的水培溶液，将上述作物根部洗净后放入含200 mL水培溶液的塑料杯中，以等量不含Rh-B的霍格兰氏营养液作为对照，将所有植株放置在25 ℃，光照/黑暗16 h/8 h 条件下培养4 d，每个处理重复4次。

1.2.2 Rh-B在作物上的荧光检测。将“1.2.1”中培养4 d后的大豆幼苗分为三叶、真叶、上胚轴、子叶、下胚轴、根6个部位，玉米分为根、叶鞘和叶3个部位，烟草分为根、茎、叶3个部位，利用立体式荧光显微镜 RFP 模块（激发波长541～551 nm，检测波长590 nm）检测上述部位。

1.2.3 Rh-B在作物不同部位的含量测定。

1.2.3.1 样品处理。分别称取按“1.2.1”方法处理的大豆幼苗三叶、真叶、上胚轴、子叶、下胚轴、根各0.5 g，玉米幼苗根、叶鞘和叶各0.5 g，烟草幼苗根、茎、叶各0.1 g，研磨后加入4 mL乙腈，超声提取40 min，浸提1 d后浓缩至1 mL，利用高效液相色谱仪测定Rh-B在大豆、玉米和烟草不同部位的含量，按照文献［16-17］的方法计算根浓度因子（RCF）和转运因子（TF）。

色谱条件：色谱柱为 Shim-pack GIST C18-AQ（5 μm，250 mm×4.6 mm），柱温35 ℃，流动相为乙腈∶0.1%甲酸水溶液=80∶20（V/V），流速1 mL/min，进样量10 μL，检测波长560 nm。

1.2.3.2 标准溶液配制及标准曲线的绘制。准确称取Rh-B 5.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到质量浓度500 mg/L Rh-B标准品溶液，随后用乙腈逐级稀释成0.411 5～300.000 0 mg/L的系列标准溶液，在“1.2.3.1”中的色谱条件下测定各标准溶液的吸收峰面积，绘制标准曲线。

1.2.3.3

添加回收率试验。在大豆、玉米、烟草各部位空白样品中分别添加质量浓度为100.000 0、33.333 3、11.111 1 mg/L Rh-B标准溶液，每组重复3次，按“1.2.3.1”方法进行样品前处理及分析，计算添加回收率及相对标准偏差。

1.2.4 Rh-B对大豆、玉米、烟草生长的影响。称量“1.2.1”处理的大豆幼苗三叶、真叶、上胚轴、子叶、下胚轴、根，玉米幼苗根、叶鞘和叶，烟草根、茎、叶各部位的鲜重，研究该质量浓度Rh-B对这3种作物生长的影响。

1.2.5

Rh-B在烟草地上部的活体荧光成像研究。取烟草八叶期幼苗，洗净后分别放入含 3.75、7.50、15.00、30.00、60.00 mg/L Rh-B的霍格兰氏营养液中，以等量不含Rh-B的霍格兰氏营养液为对照。上述幼苗在25 ℃环境下培养4 d后，清洗植株表面，利用活体成像系统检测Rh-B在烟草幼苗地上部的荧光强度。

1.2.6 数据处理。利用SPSS 20.0（α=0.05）进行单因素方差分析，利用Origin 2022进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 HPLC分析方法验证

根据“1.2.3.2”所绘标准曲线表明Rh-B质量浓度在0.411 5～300.000 0 mg/L与对应响应值呈良好的线性关系（图1），线性方程为y=1.062 5x-1.596 2，其线性方程决定系数（R2）为 0.999 6。平均回收率在 81%～109%，相对标准偏差为 0.28%，表明该方法符合分析要求。

2.2 Rh-B在植株不同部位的荧光检测

2.2.1

Rh-B在大豆幼苗不同部位的分布。通过高效液相色谱法测定大豆幼苗中Rh-B含量，其分布比例如图2A所示，Rh-B在根部含量最高，其次是真叶、下胚轴、上胚轴、子叶、三叶。通过立体式荧光显微镜观察发现，霍格兰氏营养液对照处理组中的大豆植株各部位未检测出荧光，经Rh-B处理的大豆幼苗各部位均呈现荧光且上胚轴和下胚轴荧光呈现清晰，同时，三叶和真叶叶脉中荧光强度较高，真叶较为明显，子叶内呈现荧光不明显（图3）。