刺儿菜内生细菌多样性对镉胁迫的响应
作者： 刘佳丽 李明菲 武全伟 陈鉴 陈颖慧 孙潇彤 丁瑞雪 齐磷 赵福强
摘要 ［目的］探究不同内生菌群落对镉（Cd）胁迫的响应以及对宿主Cd积累的影响。［方法］以刺儿菜内生菌为研究对象，通过土壤灭菌重塑其群落结构，利用16S rDNA基因高通量测序明确Cd胁迫下不同刺儿菜内生细菌群落结构变化及其对刺儿菜富集特性的影响。［结果］内生菌重塑（ST）处理明显改变了内生菌群落结构，增加了内生细菌群落多样性。Cd胁迫下一些能够促进植物生长的细菌，如鞘氨醇单胞菌属、德沃斯氏菌属成为优势类群。Cd胁迫处理中刺儿菜的生物量显著高于对照组，其中根、叶生物量在Cd胁迫下显著增加（P<0.05）。内生菌重塑（ST）处理显著提高刺儿菜Cd含量与Cd累积量（P<0.05）。［结论］刺儿菜植株内不同内生细菌群落对Cd胁迫的响应不同，并影响着刺儿菜对Cd的富集能力。
关键词 刺儿菜；镉胁迫；内生细菌；多样性
中图分类号 X 171 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）24-0059-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.014
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Response of Endophytic Bacterial Diversity in Cirsium arvense to Cadmium Stress
LIU Jia-li1，LI Ming-fei1， WU Quan-wei2 et al
（1. School of Life Sciences and Engineering， Shenyang University， Shenyang， Liaoning 110044;2.Guoneng Ningxia Lingwu Power Generation Co.， Ltd.， Lingwu， Ningxia 751400）
Abstract ［Objective］To explore the response of different endophytic bacterial communities to cadmium （Cd） stress and their impact on host Cd accumulation.［Method］ Taking the endophytic bacteria of C. arvense as the research object，the community structure was reshaped through soil sterilization， and high-throughput 16S rDNA gene sequencing was used to clarify the changes in the community structure of different endophytic bacteria of C. arvense under Cd stress and its impact on the enrichment characteristics of C. arvense.［Result］Endophytic reshaping （ST） treatment significantly changed the structure of endophytic bacterial communities and significantly increased their diversity.Under Cd stress， some bacteria that could promote plant growth， such as Sphingomonas and Devosia became dominant groups.The biomass of C. arvense in cadmium stress treatment was significantly higher than that in the control group， with a significant increase in root and leaf biomass under Cd stress（P<0.05）. The reshaping of endophytic bacteria （ST） significantly increased the cadmium content and accumulation in C. arvense （P<0.05）. ［Conclusion］Different endophytic bacterial communities within the C. arvense plant have different responses to Cd stress and affect its ability to accumulate Cd.
Key words Cirsium arvense;Cd stress;Endophytic bacteria;Diversity
重金属镉在土壤与植物中有较高的迁移率，不仅影响植物发育、降低作物品质与产量，甚至可以通过食物链进入人体，严重危害人类健康［1］。土壤重金属修复已经成为全球关注的热点问题。与传统的修复方法对比，植物修复具有良好的前景，利用富集或超富集植物提取、钝化或转化土壤中重金属。然而，富集植物受区域气候、环境因子以及污染物毒害等因素的影响，迫使植物修复技术的应用受限。增强植物对重金属的耐受性以及促进其对Cd的吸收与转运是提高植物修复效率的2种重要途径［2］。因此，强化富集植物对重金属土壤修复能力的研究引起了学界的广泛关注。
植物内生菌，特别是内生细菌，对于提高植物的环境适应性起到了至关重要的作用［3］。作为与植物长期协同演化的结果，植物内生细菌具有多种生物学功能，可以通过分泌植物生长激素、铁载体、ACC 脱氨酶、抗生素等来促进宿主营养吸收和生长，提高宿主对生物和非生物胁迫的耐受性和抗性［4］。植物内生细菌在重金属污染修复方面也发挥着重要作用，一些研究表明，植物内生细菌采用原位钝化的方式，通过吸附、吸收、沉淀、络合、转化等方式对重金属离子进行固定［5］，降低重金属离子的生物毒性，从而缓解重金属胁迫对宿主的损害［6］；另有研究表明，巨大芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌等植物内生细菌［7］，通过酸化根际环境、溶解金属矿物［8］、提高根表面积等机制促进植物对重金属的吸收，提高植物提取的效率［9］。目前，内生菌促进宿主应对环境胁迫作用的研究限于单一菌种的特定功能，关于内生菌群多样性和稳定性对宿主耐受性和抗性影响的研究报道较少。内生细菌的群落结构和多样性是其功能形成的重要基础［10］，主要受各种生物（如细菌种类、土壤微生物丰度、宿主植物与内生菌互作、宿主植物基因型、生态型和发育阶段等）和非生物（土壤环境）因素的影响。研究微生物群落多样性对植物内环境的稳定性及抗逆境能力的影响，对提高富集植物修复效率具有重要意义。
刺儿菜（Cirsium arvense var.integrifolium Wimm.& Grab.），是菊科蓟属多年生草本植物，适应性很强，耐寒、耐旱、耐贫瘠、任何气候条件下均能生长，且根系发达、生长快、生物量大、遍布全国各地［11］。目前对于刺儿菜的研究集中于其营养成分、药用价值等，也有关于刺儿菜对重金属具有富集能力的少量报道，但鲜见刺儿菜内生细菌群落结构及多样性对其抵御Cd胁迫相关方面的研究。刺儿菜作为一种潜在的Cd污染修复植物，研究刺儿菜内生细菌群落、强化刺儿菜富集特征、增强其修复效率具有重要意义。
该研究通过盆栽试验明确了Cd胁迫下内生细菌群落结构的响应以及刺儿菜对Cd的吸收、转运特征，为刺儿菜修复Cd污染土壤及其富集能力的强化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
盆栽试验采集沈阳市浑南区耕地的表层土壤（5～20 cm），将采集的土壤过5 mm筛，去除土内杂物，将CaCl2·2.5H2O施加到土壤中，使土壤 Cd2+添加水平为0、8 mg/kg（分别标记为Cd0、Cd8），室温条件下平衡60 d，该研究对原生土壤进行灭菌处理，改变土壤微生物群落结构（植物内生菌主要来源之一），对植物内生细菌进行重塑。将重塑处理（ST）土壤与未灭菌处理（NT）土壤进行对比，观察不同植物内生细菌群落对Cd胁迫的响应。称取5 kg土壤装入塑料袋，在高压灭菌锅中121 ℃条件下灭菌2次，每次灭菌时间为0.5 h，灭菌间隔时间为3 d。将刺儿菜种子均匀播种到盆中，出苗后，定期间苗，最终每盆保留3株植物，放置于温室内培养，刺儿菜生长旺盛期（60 d左右），采集植物进行DNA提取。
1.2 样品处理
将采集到的刺儿菜样本先在自来水下冲洗，去除表面杂质。用无菌滤纸吸干植物表面水分。选择完整的植物，切成2 cm的小段，在70%乙醇中浸泡1.5 min，无菌水冲洗3次，再对植物使用3%次氯酸钠溶液处理3 min进行表面消毒，用无菌水冲洗5次，装入无菌离心管中，最后将样品冻存于液氮中并于-80 ℃下储存直至DNA提取。
1.3 DNA提取与测序
每个刺儿菜样本用量约0.5 g，采用CTAB法进行DNA提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。采用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）对细菌V5～V7区域进行扩增，以获得目的基因片段。将不同样品的PCR扩增物寄送深圳微科盟科技集团，使用 Illumina测序平台进行上机测序。
1.4 统计分析
利用Wekemo（https：//www.bioincloud.tech/）软件处理测序结束的原始数据，包括α-多样性指数、β-多样性指数、菌群组成及丰度。试验生物量、Cd含量、Cd累积量等数据采用SPSS 26软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 Cd胁迫下刺儿菜内生细菌多样性差异性分析
总体上，Cd胁迫会降低刺儿菜内生细菌多样性，NT处理表现得更为明显。ST处理会提高刺儿菜内生细菌群落多样性（表1）。Cd胁迫（Cd8）条件下的NT处理组植物内生细菌群落Chao1指数、Shannon-Wiener指数均显著低于无外源Cd处理（Cd0）中NT组。在Cd胁迫条件下，ST处理组植物内生细菌的Chao1、Shannon-Wiener、Simpson指数均显著高于NT处理。在无Cd胁迫（Cd0）条件下，ST处理组仅Chao1指数显著高于NT组。
基于Bray-Curtis距离对Cd胁迫与内生菌重塑下刺儿菜内生细菌群落差异PCoA分析结果显示（图1），Cd胁迫与内生菌重塑均影响了刺儿菜内生细菌群落结构（P<0.05）。内生菌重塑（R2=0.218，P=0.011）对刺儿菜内生细菌群落结构的影响大于Cd胁迫（R2=0.201，P=0.028）。