冻融循环对土壤细菌群落结构和代谢功能的影响

摘要 ［目的］探究冻融循环对土壤细菌群落多样性、组成以及潜在代谢功能的影响。［方法］将采集的土壤进行不同冻融循环处理，通过高通量测序技术和Tax4Fun功能预测分析细菌群落多样性和潜在代谢功能的变化。［结果］冻融处理后，土壤理化性质与对照组差异明显，土壤细菌群落多样性随着冻融次数的增加逐渐降低；所有处理组中放线菌门（Actinobacteria）占主导地位，其次是变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）；试验土壤中总共发现了277种功能途径，关于新陈代谢的功能途径占所有功能的64.60%～65.20%，占主要地位。冻融循环次数增加不仅会改变细菌群落结构，还会影响其代谢过程。［结论］该研究为探究北方季节性冻融极端环境下土壤微生物群落代谢能力提供理论基础。

关键词 冻融循环；高通量测序；微生物；群落结构；代谢功能

中图分类号 Q 89  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）24-0062-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.015

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Freeze-thaw Cycles on Soil Bacterial Community Structure and Metabolic Function

YANG Tong，DUAN Yao-ting， LIU Yong-qi et al

（School of Energy and Environment， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou，Inner Mongolia 014010）

Abstract ［Objective］To explore the effects of freeze-thaw cycles on the diversity， composition and potential metabolic function of soil bacterial community.［Method］The collected soil was treated with different freeze-thaw cycles， we used high-throughput sequencing techniques and Tax4Fun functional prediction to analyze changes in bacterial community diversity and potential metabolic function.［Result］After freeze-thaw treatment， soil physical and chemical properties were significantly different from control group （P<0.05）， the soil bacterial community diversity decreased gradually with the increase of freeze-thaw times， and the freeze-thaw 8 cycles （C3） treatment decreased by 2.54%; Actinobacteria dominated （30.91%， 32.75% and 33.89%）， followed by Proteobacteria and Acidobacteria. A total of 277 functional pathways were found in the experimental soil， and the functional pathways related to metabolism accounted for 64.60%-65.20% of all functions， accounting for the main position. The increase of freeze-thaw cycles not only changed the bacterial community structure， but also affected its metabolic process.［Conclusion］It provided a theoretical basis for studying the metabolic capacity of soil microbial communities in extreme seasonal freezing and thawing environments in northern China.

Key words Freeze-thaw cycle;High-throughput sequencing;Microorganisms;Community structure;Metabolic functions

土壤环境中的微生物群落是多样化的，它们不断地推动着土壤生态系统进程^［1］，在土壤物质循环过程中起着不可代替的作用^［2］。冻融作用是一种由季节或昼夜温度变化所造成的土壤冻结和解冻的反复过程，是高纬度地区的一种常见现象^［3-4］。冻融作用可以使土壤结构和物质发生明显的变化^［5］，例如，冻融作用可以降低土壤团聚体的稳定性^［6］，土壤孔隙度也会增大^［7-8］，同时也会促使重金属形态变化^［9］。21世纪初，美国五大湖地区根据全球194个国家气象站的数据总结发现，1951—2000年，由于全球变暖导致冬季积雪减少，平均气温升高了1.5 ℃^［10］，土壤温度也降低。积雪减少导致的积雪隔热性的降低，会降低土壤温度改变冻融循环的频率和强度^［11-12］，并改变土壤每年被冻结的天数^［13-15］。土壤微生物群落结构和活动均受生物和非生物因素所控制^［16］，全球冻融格局的变化势必会使土壤微生物群落结构和功能发生变化^［17］。然而目前关于冻融循环作用对土壤细菌群落代谢功能影响的研究比较匮乏。

目前常见的高通量测序技术是探究微生物群落系统发育和结构组成的有力工具，但无法对微生物群落代谢潜力进行分析。Langille等^［18］使用PICRUSt预测16S rRNA基因序列的微生物群落KEGG Ortholog功能谱，这种算法通过16S rRNA基因序列将操作分类单元（OTU）与基因含量联系起来，在肠道菌群功能预测方面有一定优势；但是当微生物群落中含有未充分表征的分类时，这种分析方法可能会出现问题。Tax4Fun是一种基于16S的细菌群落功能预测分析工具。与PICRUSt相比，Tax4Fun的功能预测与宏基因组图谱具有更高的相关性^［19］。因此，该研究将微生物群落测序技术和Tax4Fun功能预测方法结合，分析了冻融循环次数对土壤细菌群落多样性和潜在代谢功能的影响，为研究北方季节性冻融极端条件下土壤细菌群落的变化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与冻融试验

试验土壤是校园内（36°37′16″N、109°49′17″E）采集的土壤，土层深度为0～20 cm。使用2 mm筛去除样本中的植物和大石块，然后进行室内冻融试验。将土壤样品置于-25 °C冷冻24 h，随后在5 °C解冻24 h，此为一个冻融周期。对试验土壤进行不同冻融处理：对照组（CK），5 °C保存；处理1（C1），2个冻融周期；处理2（C2），6个冻融周期；处理3（C3），8个冻融周期。各冻融周期结束后取出部分试验土壤保存于-80 °C冰箱中用于后续微生物试验测试。另一部分试验土壤待完全风干后过200目筛，用于后续的土壤理化分析。

1.2 土壤理化性质测定

土壤pH采用电位法（HJ 962—2018）测定，烘干法测定土壤含水率，通过灼烧减量法测定土壤有机质（OM）含量。

1.3 Illumina Miseq测序

在该研究中，根据E.Z.N.A. soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）指导书从0.5 g土壤中提取DNA。随后，采用引物338F/806R进行了PCR扩增。该试验在Illumina公司的Miseq PE300平台上完成了所有的测序过程。

1.4 数据处理

将16S rRNA基因序列通过R语言的Tax4Fun程序包，计算KEGG中的代谢循环和途径。试验中所有样品均平行重复测试3次。试验数据作图使用Orgin 2021。采用SPSS 16进行单因素方差分析（ANOVA）来确定不同处理组之间的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

经过不同处理的土壤基本理化性质如表1所示。各处理组的含水率均显著高于CK组，C1、C2、C3处理组较CK组分别提高了9.41%、17.43%和20.88%，C3组含水率最高。CK样本的pH最大，经过冻融循环后土壤的pH有所降低，C1、C2、C3处理组分别降低了0.06、0.07和015。冻融循环对土壤有机质含量的影响最大，土壤有机质含量明显提高，C1、C2、C3处理组较CK组分别提高了8277%、23.84%和13.93%，C1组有机质含量最高。

2.2 土壤细菌群落多样性

维恩图可以清晰地看出不同冻融循环次数下土壤细菌群落组成的相似性及重叠情况（图1）。从图1可以看出，所有处理中共有的OTU种类为1 385种，占总OTU数的87.40%。对照组CK中有2种独特的OTU，而C1、C2、C3中分别有2、1、3种特有的OTU种类。此外，4个处理中，C2含有最多的OTU种类（1 513个），C3中最少（1 511个）。

同时该研究进行了不同冻融循环次数下土壤细菌群落Alpha多样性指数分析，结果发现（表2），所有处理组别土壤细菌的覆盖度均在99%以上。CK中Shannon-Wiener指数最高，经过8次冻融循环（C3）后Shannon-Wiener指数最低，Simpson指数随着冻融循环次数的增加而增加，这表明随着冻融循环次数的增加土壤细菌群落多样性逐渐降低。

2.3 土壤细菌群落结构组成

不同冻融循环次数下门水平的土壤细菌群落组成结构如图2所示。4个组别中物种丰富度最高的菌门是放线菌门（Actinobacteria），它在CK、C1、C2、C3处理中占比分别为30.71%、30.91%、32.75%和33.89%，随着冻融次数增加在土壤中的占比增大。第二大优势门类是变形菌门（Proteobacteria），经过2次冻融循环（C1）相对丰度达到最低，随后逐渐增加，经过8次冻融循环（C3）土壤中变形菌的占比达到最高，较C1组占比增加了11.13%。酸杆菌门（Acidobacteria）是第三大优势菌门，经过2次冻融循环（C1）相对丰度达到最高，随后逐渐降低。其他优势细菌门包括绿弯菌门（Chloroflexi，8.87%～11.06%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，4.45%～5.33%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，190%～2.40%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，1.66%～200%）、浮霉菌门（Planctomycetes，0.95%～1.31%）和厚壁菌门（Firmicutes，0.81%～1.08%）。其中拟杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和厚壁菌门的相对丰度在冻融循环过程中呈先减后增的趋势。此外，浮霉菌门相对丰度的变化趋势则随着冻融循环次数的增加呈下降趋势，在C3中相对丰度最低。

基于Bray-Curtis相似性指数的层次聚类热图显示了4个不同处理样品的前10个细菌属之间的层次关系（图3）。结果表明，CK与C1相关，C2与C3相关。这说明多次冻融循环使得土壤细菌群落结构发生了变化。4个处理（CK、C1、C2、C3）中最具代表性的菌属是Subgroup_6，相对丰度