长白山山兰组织培养技术研究

摘要 ［目的］研究山兰组织培养条件。［方法］以长白山山兰（Oreorchis patens）的假鳞茎为研究材料，分析消毒处理、激素组合、生根培养等对山兰假鳞茎组织培养的影响，筛选最佳消毒处理组合和假鳞茎不同阶段的最适培养基。［结果］山兰假鳞茎最适消毒处理为75%乙醇45 s+0.1%升汞表面消毒5 min，无菌苗污染率为10.94%，成活率为87.62%；山兰最佳的增殖、分化和生根培养基均为1/4 MS+1.5 mg/L ZT+0.050 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂，pH 5.6，增殖率为78.89%，分化率为88.34%，生根率为83.85%。［结论］该研究建立了山兰的组织培养再生体系，可为长白山区其他濒危植物的保护和繁育提供技术支撑与开发基础。

关键词 山兰；组织培养；消毒处理；激素组合；生根培养；假鳞茎

中图分类号 S 567.23  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）24-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on Tissue Culture Technology of Oreorchis patens in Changbai Mountain

WANG Yuan1，LU Shuang2，SHA Yue1 et al

（1.College of Life Sciences，Changchun Normal University，Changchun，Jilin 130000;2.Key State-owned Forestry Technology Service Center of Jilin Province，Changchun，Jilin 130000）

Abstract ［Objective］To study the tissue culture conditions of Oreorchis patens.［Method］The pseudobulbs of Oreorchis patens in Changbai Mountain were used as research materials to analyze the effects of disinfection treatment，hormone combination and rooting culture on the tissue culture of pseudobulbs of Oreorchis patens in order to screen the best disinfection treatment combination and the optimal medium for different stages of pseudobulbs.［Result］The optimal disinfection treatment of pseudobulbs was 75% alcohol for 45 s + 0.1% mercuric chloride for 5 min，the contamination rate of aseptic seedlings was 10.94%，and the survival rate was 87.62%.The best medium for proliferation，differentiation and rooting was 1/4 MS + 1.5 mg/L ZT + 0.050 mg/L NAA + 20 g/L sucrose + 8 g/L agar，pH 5.6，and the proliferation rate was 78.89%，the differentiation rate was 88.34%，and the rooting rate was 83.85%.［Conclusion］This study established the tissue culture and regeneration system of Oreorchis patens，which can provide technical support and development basis for the protection and breeding of other endangered plants in Changbai Mountain area.

Key words Oreorchis patens （ Lindl.） Lindl.;Tissue culture;Disinfection treatment;Hormone combination;Rooting cultivation;Pseudobulbs

长白山山兰［Oreorchis patens （Lindl.） Lindl.］为兰科（Orchidaceae）山兰属（Oreorchis）多年生附生草本植物，也被人们叫做“冰球子”^［1］。野生广泛分布于中国东北地区（黑龙江、辽宁和吉林）、西南（四川、贵州和云南北部）、西北（甘肃）、华中（江西、湖南）和台湾，主要分布于海拔1 000～3 000 m 的林下、林缘、灌丛、草甸或沟谷旁^［2］。经过干燥处理的假鳞茎可以作为药材，其叶片一般呈现1～2片，6月底叶子逐渐开始枯萎，7月底又萌发新叶^［3-4］，其味甘、性寒、辛，有小毒，具有滋阴补肾、清热解毒、益气养生、消痈散结的功效，用于瘰疬、无名肿毒、痈疳疮肿、蛇虫咬伤等的治疗^［5-6］。民间把山兰作为山慈菇来入药，俗称“山芋头”^［7］。山慈菇作为一味历史悠久的常用药材，自古以来便拥有广泛的应用传统，在《中国药典》中，山慈菇这一药材被明确记载其植物来源包括杜鹃兰［Cremastra appendiculata （D.Don） Makino］、独蒜兰［Pleione bulbocodioides （Franch.） Rolfe］和云南独蒜兰［Pleione yunnanensis （Rolfe） Rolfe］^［8-9］。此外，据《中华本草》与《中药大辞典》记载，来自山兰属的植物如山兰、独叶山兰等的假鳞茎，同样被认定为山慈菇的有效入药部分^［10-11］。近年来，由于山慈菇的3种原植物供不应求，长白山地区大量收购山兰，导致野生山兰储量锐减，成为珍稀植物。因此，笔者采用组织培养技术进行快速繁殖是保护长白山山兰野生资源和解决山兰稀缺的有效办法，以期得到最优的山兰组织培养条件，创新山兰组织培养和快繁技术，为长白山山兰种质资源保存、精准利用和规范化育苗等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 2023年5月取长春师范大学种质保存中心在通化县兴林镇阔叶林下仿生态栽培的3年生山兰假鳞茎萌发新芽作为组织培养材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒。

山兰假鳞茎流水冲洗15 min，表面冲洗干净后，将其放在超净工作台上，用75%乙醇浸泡30、45、60 s，无菌水冲洗3～5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒4、5、6 min，最后无菌水冲洗3～5次，将不同消毒处理组合（表1）进行正交试验设计。

1.2.2 假鳞茎增殖培养中激素组合筛选。以1/4 MS培养基作为基本培养基，培养基中添加蔗糖20 g/L和琼脂8 g/L，调节pH为5.6，以玉米素（ZT）、萘乙酸（NAA）为不同因素，设置不同浓度水平进行正交试验设计（表2），ZT设置0.5、1.0、1.5 mg/L 3个浓度梯度，NAA设置0.025、0.050、0.100 mg/L 3个浓度梯度，共9个处理。

1.2.3 假鳞茎分化为球茎培养中激素组合筛选。以假鳞茎增殖培养基为参照，继续筛选最适假鳞茎分化为球茎的激素组合。

1.2.4 球茎生根培养中激素组合筛选。以假鳞茎增殖培养基为参照，继续筛选最适球茎生根的激素组合。

1.2.5 培养条件。取山兰假鳞茎进行诱导，在基本培养基中添加不同种类的植物生长激素应用于不同培养阶段，使用1 mol/L 的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液调节培养基pH。设置（25±2）℃、光照强度1 000 lx、每天光照12 h的培养室条件。

1.3 数据统计与分析 通过Excel和SPSS统计软件对测定数据进行整合与处理，并利用Duncan新复极差测验法对其进行显著性分析，以获得更加精确的结果。试验数据表示为平均值±标准差。数据统计和分析的相关计算公式如下：

污染率=污染的假鳞茎数／接种假鳞茎总数×100%

成活率=正常生长的假鳞茎数／接种假鳞茎总数×100%

增殖率=假鳞茎增殖数／接种假鳞茎数×100%

分化率=分化球茎数／接种假鳞茎数×100%

生根率=生根的球茎数／接种球茎数×100%

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理组合对灭菌效果的影响

山兰假鳞茎经过消毒灭菌处理，每瓶接种一个假鳞茎，每30瓶为一个处理，3次重复，在空白的1/4 MS培养基中培养7 d后不同组合消毒处理的消毒效果见表3。从表3可以看出，不同消毒处理组合对山兰假鳞茎的污染率和成活率有一定影响，所选的处理组合需要兼具较高的成活率和较低的污染率。污染率最高的组合是序号1，为49.98%，其灭菌效果是最差的；序号5污染率是最低的，为10.94%；其次是序号4和序号9，2个处理组合之间没有显著的差异。成活率比较高且达到70%以上的处理组合有序号1、4、5，其中序号5的成活率最高，为87.62%；序号9的污染率较低（19.33%），但其成活率同样也很低，为30.58%，这表明消毒剂的使用时间过长，会损害假鳞茎的生命力。所有消毒处理组合中序号5满足较高的成活率和较低的污染率，因此，山兰假鳞茎最适消毒处理为75%乙醇45 s+0.1%升汞表面消毒5 min。

2.2 不同培养基对假鳞茎增殖的影响 从表4可以看出，不同浓度配比的培养基对山兰假鳞茎增殖的影响具有明显差异。除了1/4 MS+0.5 mg/L ZT培养基中，随着NAA浓度的升高，假鳞茎增殖率呈逐渐升高的趋势，其他不同培养基在统一1/4 MS和ZT浓度时，随着NAA浓度的升高，假鳞茎增殖率均先升高后降低。其中，当培养基为1/4 MS+1.5 mg/L ZT+0.050 mg/L NAA时，假鳞茎增殖率最高，为78.89%。因此，山兰假鳞茎增殖的最适培养基为1/4 MS+1.5 mg/L ZT+0.050 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂，pH 5.6。在最适培养基中山兰假鳞茎的增殖情况如图1所示。

2.3 不同培养基对假鳞茎分化为球茎的影响 从表5可以看出，不同浓度配比的培养基对山兰假鳞茎分化为球茎的影响具有明显差异。在1/4 MS+1.5 mg/L ZT+0.050 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂、pH 5.6的分化培养基中培养时，分化率最高，为88.34%，瓶苗长势最佳（图2）。

2.4 不同培养基对球茎生根的影响 从表6可以看出，不同浓度配比的培养基对山兰球茎生根的影响具有明显差异。除了1/4 MS+1.0 mg/L ZT培养基中，随着NAA浓度的升高，假鳞茎生根率呈逐渐降低的趋势，其他同一单因素变量下生根率则是呈先升高而后降低的趋势；在1/4 MS+1.5 mg/L ZT+0.050 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂、pH 5.6的生根培养基中，球茎生根率最高，为83.85%。在最适培养基中山兰假鳞茎的生根情况如图3所示。

3 结论与讨论

山兰作为一种名贵的药材在医药方面发挥重要作用，由于其有较高的药用价值和经济价值，人们为获取利益进行贪婪的开采，导致山兰的野生资源急剧流失，使其生态环境遭受了严重破坏，其自然条件的繁殖方式已无法满足市场需求^［12-13］。因此对山兰的组织培养研究势在必行。近年来，已有学者对山兰外植体（种子、原球茎等）进行组织培养技术研究^［14-15］。张正海等^［14］研究发现，将消毒处理好的山兰种子播撒在相应培养基上进行无菌萌发，可以观察萌发过程种子的形态变化；张正海等^［15］选用“原球茎增殖-原球茎分化为球茎-球茎生根”的组培流程，这为该试验提供一定的思路。