烟叶醇化初期烤甜香风味物质形成规律

摘要 通过跟踪测定烟叶中淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活力，以及美拉德反应底物、美拉德反应中间体和典型烤甜香风味物质等在醇化初期的变化，探究烤甜香风味物质的形成规律。结果表明：烟叶中淀粉酶活力、纤维素酶活力、总还原糖和美拉德中间体总量在180 d醇化期呈先升高后降低的变化规律，蛋白酶活力、游离氨基酸总量、蔗糖、葡萄糖和果糖呈逐渐降低的趋势，而糠醇、5-甲基糠醛、麦芽酚、呋喃酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮5种典型的烤甜香风味物质含量呈逐渐升高的趋势。相关性分析发现，游离氨基酸和葡萄糖与美拉德中间体变化均呈正相关，美拉德中间体总量和烤甜香风味物质总量变化呈负相关。在醇化初期，烟叶中淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的活力对美拉德中间体的形成和烤甜香风味物质的增加有重要影响。

关键词 烟叶；醇化；烤甜香；美拉德中间体；形成规律

中图分类号 TS 41+1  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）24-0158-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.035

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The Formation Rules of Flavor Substance with Roasted Sweet Aroma in Leaves During the Early Stage of Aging

CHAI Ying，QIAO Yue-mei，GUO Chun-sheng et al

（Technical Center，Inner Mongolia Kunming Cigarette Co.，Ltd.，Hohhot，Inner Mongolia 010000）

Abstract Through tracking and detecting the activities of amylase，protease，and cellulase，as well as the changes in Maillard reaction substrates，Maillard reaction intermediates，and typical roasted sweet flavor substances in tobacco leaves during the early stage of aging，the formation rules of flavor substances with roasted sweet aroma were explored.The results show：the activities of amylase，cellulase，total reducing sugar and Maillard intermediates in tobacco leaves increased first and then decreased during the 180 d aging period.The activities of protease，total free amino acids，sucrose，glucose and fructose decreased gradually.The contents of five typical flavor substances，such as furfuryl alcohol，5-methylfurfural，maltol，furanone and 3-methyl-2-cyclopentene-1-ketone，increased gradually.The free amino acids and glucose are positively correlated with Maillard intermediates，while there is a negative correlation between the total amount of Maillard intermediates and the total amount of roasted sweet flavor substances.So in the early stage of aging，the activity of amylase，cellulase，and protease in tobacco leaves has a significant impact on the formation of Maillard intermediates and the increase of roasted sweet flavor substances.

Key words Tobacco leaves;Age;Roasted sweet aroma;Maillard intermediates;Formation rules

烟草是一种以吸食为主要目的的特殊经济作物，也是我国重要的农业经济作物之一。烟草中主要化学成分的含量和比值影响着烟草的吸食品质，进而决定了烟草的工业使用价值，而醇化是烟叶吸食品质形成的重要环节^［1］。醇化过程根据处理条件和方法不同，分为自然醇化和人工发酵2种^［2］。自然醇化是将烤烟放置在醇化库中，在自然条件下借助生化作用发生成分变化进而改善质量的过程，是目前烟草行业主要的生产工艺。人工发酵法是将新烟放在发酵室内，通过控制温度、湿度条件来加速烟叶的生化作用，在短时间内（一般为 12～15 d）改善烟叶品质^［3-4］。

在烟叶醇化过程中，美拉德反应是其品质提高的主要原因之一。重要的香味前体物质——美拉德反应中间体（Amadori化合物和Heyns化合物）在这个反应中形成，主要为1-氨基-1-脱氧-2-酮糖类化合物^［5-7］。美拉德反应中间体常温下化学性质相对稳定，但加热后易裂解产生吡嗪类、呋喃类及糠醛类等化合物，这些化合物中的糠醇、5-甲基糠醛、麦芽酚、呋喃酮、3-甲基-2-环戊烯-1-酮等物质是烟叶烤甜香风味形成的典型组分^［8-10］。

烤甜香是评价烟叶质量的重要指标之一，优质烟叶要求烤甜香气充足，余味舒适，吸食安全性高。近年来，有学者也证实了烟叶中烤甜香风味物质对烟叶的感官有重要贡献^［11］，并通过添加这些物质开发了具有甜香风格的烟草制品^［12］。但目前关于醇化期间烟叶中淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的酶活力变化与美拉德反应进程之间的关系，以及最终对烤甜香风味物质形成的影响尚不清晰，有待进一步研究。

笔者以复烤后的烟叶为原料对其进行醇化处理，并对180 d醇化期间烟叶中淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的酶活力变化，美拉德反应的主要底物、中间体和典型烤甜香风味物质进行测定和分析，以期为后续烟叶新工艺的开发优化奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 仪器。

超高效液相色谱仪-串联三重四极杆质谱仪（型号：1290-6460）：美国 Agilent公司。精密电子pH计（型号：PB-10）：赛多利斯科学有限公司。Sigma高速离心机（型号：3-18KS）：上海成贯仪器有限公司。恒温恒湿培养箱（型号：BPS-100CL）：上海恒一科学仪器有限公司。电热恒温鼓风干燥箱（型号：DHG-9053A）：上海恒一科学仪器有限公司。紫外可见分光光度计（型号：T6）：北京普析通用仪器有限责任公司。氨基酸自动分析仪（型号：LA8080）：日立高新科学公司。气相色谱-质谱联用仪（型号：7890B-7000C）：美国 Agilent公司。液相色谱仪（型号：1200）：美国 Agilent公司。

1.1.2 试剂。

3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。Whatman 1号滤纸条（定性滤纸）：格来赛生命科技（上海）有限公司。Folin试剂（分析纯）：北京酷来搏科技有限公司。酪蛋白（分析纯）：北京酷来搏科技有限公司。L-酪氨酸（分析纯）：北京酷来搏科技有限公司。麦芽糖（分析纯）：北京酷来搏科技有限公司。氨基葡萄糖（2-氨基-2-脱氧葡萄糖、纯度99％）、Fru-Val（Fructose Valine、果糖-缬氨酸、纯度98％）、Fru-Pro（Fructose-proline、果糖-脯氨酸、纯度98％）、Fru-Ile（Fructose-isoleucine、果糖-异亮氨酸、纯度97％）、Fru-Phe（Fructose-phenylalanine、果糖-苯丙氨酸、纯度98％）、Fru-Leu（Fructose-leucine、果糖-亮氨酸、纯度98％）、Fru-Asn（Fructose-asparagine、果糖-天冬氨酸、纯度98％）、Fru-Ala（Fructose-alanine、果糖-丙氨酸、纯度96％）、Fru-Trp（Fructose-tryptophan、果糖-色氨酸、纯度98％）：加拿大TRC公司。甲酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司产品。乙腈（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。果糖（色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司。葡萄糖（色谱纯）：Dr.Ehrenstorfer GmbH。乳糖（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。半乳糖（色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司。蔗糖（色谱纯）：Dr.Ehrenstorfer GmbH。麦芽糖（色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司。糠醇、5-甲基糠醛、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、4-羟基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、麦芽酚（色谱纯）：上海甄准生物科技有限公司。

1.1.3 供试烟叶。烟叶：云南昆明C2F等级，复烤未醇化，2020年份。

1.2 试验方法和条件

1.2.1 淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活力的测定。

将烟叶放置于恒温恒湿箱中（温度25 ℃，相对湿度55%），于2020年10月开始进行醇化，在醇化期间每隔30 d采样1次，共6次。淀粉酶活力采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定^［13］；结合国标GB/T 28715—2012，采用福林-酚法测定蛋白酶活力；结合国标GB/T 23881—2009，以滤纸为底物测定纤维素酶活力。

1.2.2 总还原糖含量的测定。

总还原糖含量的参照文献［14］，用紫外分光光度法进行测定。

1.2.3 主要糖类含量的测定。

结合文献［15］，采用高效液相色谱法通过示差折光检测器对果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖进行测定。

样品前处理：将烟叶粉碎，过40目筛，准确称取样品2.0 g，加蒸馏水混合均匀并定容于50 mL 容量瓶中，摇匀，静置30 min后再摇匀，取溶液超声30 min，再取超声后溶液于离心管中，在 4 ℃、8 000 r/min下离心3 min，取上清液过0.45 μm 水相滤膜，供液相色谱分析。

1.2.4 游离氨基酸含量的测定。采用氨基酸分析仪（茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪）测定烟叶中游离氨基酸的含量。

样品前处理：将烟叶粉碎，过40目筛，准确称取样品2.0 g，加入200 mL沸水冲泡，沸水浴加热10 min，每隔5 min摇匀1次。然后进行抽滤，滤液冷却后定容至250 mL，定容后取2 mL用0.22 μm 水相滤膜过滤备用。

1.2.5 美拉德中间体的测定。

结合文献［16-17］，采用Waters Acquity PDA 检测器和 ESI+模式的质谱仪对美拉德中间体化合物进行分析。

样品前处理：将烟叶粉碎，过40目筛，准确称取样品1.0 g，加入50  mL水超声提取20 min，提取后的样品在13 000 r/min离心机中离心10 min。取上清液2 mL过C18小柱，用3  mL超纯水洗脱并定容至10  mL。然后过0.22 μm 滤膜，上机待测，进样量为2 μL。