饲料中添加不同水平的鸡肠粉对鲤肠道菌群结构的影响

摘要 为研究饲料中添加新型蛋白源鸡肠粉对鲤（Cyprinus carpio）肠道菌群的影响，选取初始体重为（57.30 ±0.10）g的鲤150尾，随机分为5组，每组10尾鱼，分别投喂鸡肠粉添加量为0%（D1组）、5%（D2组）、10%（D3组）、15%（D4组）、100%（D5组）的试验饲料，进行56 d养殖试验。饲养结束后，采集肠道样品，基于Illumina Miseq PE300平台进行高通量测序。结果表明，饲料中添加10%和15%的鸡肠粉降低了鲤肠道菌群的多样性，但具有改善肠道菌群结构的效果。D3、D4组α多样性显著低于D1组（P<0.05）。D3组降低了变形菌门（Proteobacteria）和邻单孢菌属（Plesiomonas）相对丰度，D3、D4组鲸杆菌属（Cetobacterium）和气单孢属（Aeromonas）相对丰度升高。表明在鸡肠粉添加量为10%时，鲤肠道致病菌相对丰度最低，有益菌相对丰度最高，对鲤肠道菌群结构有最好的改善作用。

关键词 鸡肠粉；鲤；高通量测序；肠道菌群

中图分类号 S 963  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）01-0085-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.01.018

Effects of Different Levels Chicken Intestine Meal Supplementation on the Community Structure of Intestinal Microflora of Cyprinus carpio

PENG Zu-xiang， YAN Lin，  WEI Li-bo et al

（College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian， Liaoning  116023）

Abstract A 56 d feeding trial was conducted to evaluate the effects of chicken intestine meal on intestinal microbiota of Cyprinus carpio. A total of 150 Cyprinus carpio with an initial body weight of （57.30±0.10） g were randomly divided into 5 groups with 3 replicates per group and allocated 10 fish in each replicate. The fish were fed expeimental diets supplemented with 0% （group D1），5% （group D2），10% （group D3），15% （group D4） and 100% （group D5） chicken intestine meal. After rearing， intestinal samples were collected and high-throughput sequencing was performed based on the Illumina Miseq PE300 platform. The results showed that the addition of 10% and 15% chicken intestinal meal to the feed reduced the diversity of the carp intestinal flora， but had the effect of improving the structure of the intestinal flora. The alpha diversity of the D3 and D4 groups was significantly lower than that of the D1 group （P<0.05）. The relative abundance of Proteobacteria and Pleomorphomonas was reduced in the D3 group and increased in the D3 and D4 groups for Cetobacterium and Aeromonas. The study showed that at 10% chicken intestinal meal addition， the carp intestinal pathogenic bacteria abundance was relatively lowest and the relative abundance of beneficial bacteria was highest， which had the best effect on improving the carp intestinal flora structure.

Key words Chicken intestine meal;Cyprinus carpio;High-throughput sequencing;Bacterial community

基金项目 辽宁省教育厅青年科技人才“育苗”项目（QL202004）；大连海洋大学“蔚蓝英才”人才计划项目。

作者简介 彭祖想（1997—），男，安徽宿州人，硕士研究生，研究方向：水产动物营养与饲料学。

通信作者，副教授，博士，从事水产动物营养与饲料学研究。

收稿日期 2022-01-12

近年来由于鱼粉资源的匮乏和高昂的价格导致鱼粉资源的不稳定性，限制了水产养殖行业的可持续发展。当今迫切需要开发一种蛋白含量高、价格低廉、易获得且供应稳定的新型饲料蛋白源以满足水产饲料行业的需求。鸡肠粉是家禽副产品粉（poultry by-product meal，PBM）的一种，是以新鲜鸡肠为原料，经冲洗、蒸煮、喷雾干燥和粉碎等工序加工而成的新型优质饲料蛋白源。优质的鸡肠粉粗蛋白和粗脂肪含量与鱼粉接近，部分必需氨基酸含量甚至高于鱼粉，从营养成分及氨基酸组成分析，鸡肠粉是一种较有潜力的优质动物蛋白［1］。目前国内对鸡肠粉的研究较少，笔者所在实验室前期的研究表明，鸡肠粉能够完全替代鲤饲料中的鱼粉，不会对鲤生长、消化和免疫等指标造成负面影响，但并未对肠道菌群结构的影响进行深入研究［2］。鲤（Cyprinus carpio）属于杂食性鱼类，是我国重要的淡水经济养殖品种，在水产养殖中占有很大比重。据统计，2020年我国鲤养殖产量达289.67万t，较2019年增加1.14万t，增幅0.92%［3］。作为大宗淡水鱼，鲤饲料对鱼粉的需求巨大，该研究以鲤为研究对象，探究鸡肠粉对鲤肠道菌群的影响，以期减少淡水鱼养殖产业对鱼粉的依赖，促进水产养殖行业的可持续发展。

鱼类肠道内存在数量巨大的微生物菌群，菌群之间相互制约、相互平衡，构成了一个稳定的生态系统［4］。肠道菌群对于维持肠道健康、促进消化吸收、抑制病原菌、增强免疫应答及促进生长发育方面有重要作用［5］。研究表明，鱼类肠道内细菌的组成和分布由营养需求所决定［6］，且菌群结构很大程度上取决于饵料成分［7］。郁二蒙等［8］使用冰鲜杂鱼和人工配合饲料饲喂大口黑鲈（Micropterus salmoides），发现投喂冰鲜杂鱼的大口黑鲈与投喂人工配合饲料的大口黑鲈肠道菌群相似性较低，冰鲜杂鱼组肠道菌群丰富度高于人工配合饲料组。王亚如［9］研究发现，高水平的豆粕替代鱼粉会很大程度改变花鲈（Lateolabrax japonicus）前肠肠壁优势菌群数量组成，导致有益菌（芽孢杆菌）数量降低。殷彬［10］研究表明，当饲料中浓缩棉籽蛋白替代鱼粉比例达60%时，珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatu♂）前中肠菌群丰度失调，不再存在优势菌。钟雷等［11］研究发现，随着饲料中脱脂蚕蛹替代鱼粉比例的增加，建鲤（Cyprinus carpio var.jian）肠道菌群多样性和益生菌属数量均呈下降趋势。耿彬等［12］研究发现，饲料中添加不同水平的玉米干酒糟及其可溶物能够提高斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肠道有益菌（鲸杆菌属）丰度，降低有害菌（乳球菌属）丰度。笔者基于鲤营养研究基础，探究饲料中添加不同水平的鸡肠粉对鲤肠道菌群结构的影响，分析肠道菌群的组成，以期为鲤健康养殖以及饲料中合理使用鸡肠粉提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计和管理

试验所用鲤幼鱼购自辽宁省丹东市某养殖场，在4.3 m×1.5 m×1.2 m的水泥池中暂养14 d以熟悉试验环境，期间投喂对照组饲料。养殖试验在大连海洋大学辽宁省北方鱼类生物学及增养殖重点实验室循环水池（4.3 m×3.0 m×1.4 m）进行，采用网箱进行养殖。选取初始体重为（57.30 ±0.10） g 的鲤150尾随机分为5组，每组3个重复，每个重复10尾，置于15个1.3 m×0.8 m×0.7 m的聚乙烯网箱中。养殖周期为56 d，每日投喂2次（09：00和17：00）表观饱食，每日吸底1次、换水1 次，换水量约为 1/5。试验水体为曝气24 h以上的自来水，试验期间光照为自然光照，水体温度为（27.0±1.0）℃，溶氧为（7.0±0.5）mg/L，pH为（7.6±0.5）。

1.2 试验饲料

鸡肠粉由辽宁省鞍山裕丰饲料有限公司提供，粗蛋白65.47%，粗脂肪14.80%，其他试验饲料原料均购自于大连当地市场。试验饲料配方见表1，以鸡肠粉、鱼粉、豆粕等为主要蛋白源，以豆油为主要脂肪源配制4组等氮等脂的饲料和1组负对照组（鸡肠粉含量为100%）的饲料，标记为D1、D2、D3、D4、D5。添加量分别为0（D1组）、5%（D2组）、10%（D3组）、15%（D4组）、100%（D5组）。饲料原料过60目筛，混合均匀后经制粒机制成2 mm的颗粒饲料，放入42 ℃烘箱中，烘干至水分含量为10%，放入自封袋中于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 样品采集

试验结束后，试验鱼停食 24 h，使用50 mg/L的MS-222溶液麻醉。从每个网箱中随机取3条鱼，使用无菌剪刀于冰上进行解剖，取带有内容物的前中肠置于无菌5 mL离心管中，-80 ℃冷冻保存，用于总DNA提取。

1.4 总DNA提取、PCR扩增及高通量测序

取鲤的前中肠样本按照OMEGA E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit（Omega，美国）试剂盒说明书进行总DNA提取，使用Qubit3.0 Q32866荧光计检测DNA浓度和纯度，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量。总DNA根据16S rRNA基因V3-V4引物：341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）；805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）在ETC811型PCR仪上进行PCR扩增。利用Illumina Miseq PE300平台（上海生工生物技术有限公司）进行高通量测序。

1.5 数据处理

采用Cutadapt、Pear、Prinseq软件处理原始数据，原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH 软件进行拼接，利用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类。最后利用RDP对每条序列进行物种分类注释，后续多样性分析均在上海生工生物技术有限公司分析平台进行。