基于转录组技术的枫叶鲑亲本鉴定和杂交优势分析

摘要 为探究枫叶鲑的亲本来源及杂种抗病优势，采用Illumina高通量测序技术对枫叶鲑的胸腺和头肾组织转录组进行测序分析。结果获得胸腺组织原始数据8 224 345 800 bp，拼接获得169 204条单基因序列（Unigene）；头肾组织原始数据7 409 864 400 bp，拼接获得132 292条Unigene。利用生物信息学方法对Unigene进行NR库相似搜索，还进行了GO、KOG和 KEGG分类注释。通过比对线粒体DNA（mtDNA）基因序列发现，枫叶鲑与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的线粒体基因同源性达99%以上，可判定枫叶鲑母本是虹鳟；E3、TNF-α、IGM等基因的同源性在大鳞大麻哈鱼（Oncorhynchus tshawytscha）中比虹鳟高，推测枫叶鲑父本可能是大鳞大麻哈鱼。对免疫相关基因分析发现，IgM、TNF-α和T、B淋巴细胞相关基因序列与父、母本同源性均较高，因此初步判定枫叶鲑抗病优势是父、母本双方杂交的结果。通过转录组分析杂交种的抗病优势存在盲区，但该技术可以快速判断父、母本的来源，获得大量遗传信息，优势明显。

关键词 枫叶鲑；转录组；亲本鉴定；抗病优势分析

中图分类号 S 917.4  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）01-0098-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.01.021

Parental Identification and Hybrid Vigor Analysis of Maple Salmon Based on Transcriptome Technology

LIU Yu-meng1，JIANG Jie-lan2，3，MAO Ming-guang2，3 et al

（1.College of Ocean Technology and Environment， Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023;

2.Yazhouwan Innovation Research Institute， Hainan Tropical Ocean University，  Sanya， Hainan 572024；3.Key Laboratory of Utilization and Conservation for Tropical Marine Bioresources，Ministry of Education/Hainan Tropical Ocean University，Sanya，Hainan 572022）

Abstract In order to explore the parent origin and hybrid disease resistance of maple salmon，Illumina high-throughput sequencing technology was used to sequence and analyze the transcriptome of thymus and head kidney tissues of maple salmon.The original data of thymus tissue was 8 224 345 800 bp，and 169 204 Unigene were obtained by splicing;the original data of head kidney tissue was 7 409 864 400 bp and 132 292 Unigenes were obtained by splicing.Using bioinformatics method，we searched the NR database of Unigene，and annotated GO，KOG and KEGG.By comparing the mitochondrial DNA （mtDNA） gene sequence，it was found that the mitochondrial gene homology of Oncorhynchus mykiss and maple salmon was more than 99%，and it could be determined that the female parent of maple salmon was rainbow trout; the homology of E3，TNF-α IGM and other genes in Oncorhynchus tshawytscha is higher than that in rainbow trout.It is speculated that the male parent of maple salmon may be Oncorhynchus tshawytscha.Analysis of immune related genes revealed that IgM and TNF-α sequences of genes related to T and B lymphocytes are highly homologous with their parents，so it is preliminarily determined that the disease resistance of maple salmon is the result of hybridization between parents.There is a blind spot in the disease resistance advantage of hybrids by transcriptome analysis，but this technology can quickly determine the source of parents and mothers，obtain a lot of genetic information，and has obvious advantages.

Key words Maple salmon;Transcriptome;Parent identification;Disease resistance advantage analysis

基金项目 海南热带海洋学院崖州湾创新研究院开放课题（2022CXYK-FKT06）；海南省自然科学基金项目（322RC716，422MS083）；

海南热带海洋学院引进人才科研启动资助项目（RHDRC202119，RHDRC202206）。

作者简介 刘玉猛（1996—），男，湖南郴州人，硕士研究生，研究方向：海洋生物学。 通信作者，副教授，硕士生导师，从事海洋生物学研究。

收稿日期 2022-02-07

鲑鳟，是鲑鱼和鳟鱼的统称［1］。我国鲑鳟养殖是从20世纪60年代开始的，经历了60多年的发展，已经形成了一定的产业规模，并带来了巨大的经济效益［2］。随着国内需求的增加，养殖体量也不断增加，2018年我国第一个深海网箱建成并投入使用［3］，我国鲑鳟受精卵受制于欧洲，苗种是目前亟待解决的问题，优质的苗种可为下游养成打好基础和保障。

丹东华美渔业有限公司位于丹东市鸭绿江畔，该公司以鸭绿江为基地，从国外引种优质杂交鲑，并进行了推广养殖，是当地重要的创汇来源之一。其引进的杂交鲑优点明显，生长速度快，抗病力强，肉质优良，因肉色似枫叶的颜色，故名“枫叶鲑”。由于枫叶鲑属于外来物种，且商业品系的信息不全面，尤其是其遗传信息不明确，这为我国自主繁育造成了瓶颈，也对该地区物种来说是一种潜在的风险。

转录组测序技术已广泛应用于生物学领域［4-5］，但其在鱼类亲子鉴定方面鲜见报道。笔者利用Illumina高通量测序技术对枫叶鲑胸腺和头肾组织进行转录组测序，通过转录本拼接、基因功能注释，揭示枫叶鲑的基因表达特点，根据线粒体母源传递的特点，通过对转录组中线粒体基因比对分析，确定其母本来源，并根据免疫相关基因的转录探讨枫叶鲑抗病优势的原因，旨在为今后利用转录测序技术快速揭示未知来源物种的遗传信息提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 枫叶鲑由丹东华美渔业有限公司提供，为400 g。采样所需的手术剪、咬骨钳、镊子等器械均事先通过高压灭菌锅进行121 ℃，2 h 灭菌，采样前使用75%乙醇擦拭且经火焰消毒。将试验鱼解剖，分别取胸腺和头肾组织储存于10倍体积的 RNA later。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取及质量检测。利用RNA提取试剂盒提取枫叶鲑胸腺和头肾的总RNA。为了保证试验数据的高质量，将上述提取的RNA用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计检测其纯度与浓度。将检验合格的RNA用于构建cDNA文库。将上述cDNA文库利用Qubit DNA检测试剂盒对回收的DNA 精确定量，以方便按照1∶1 的比例等量混合后进行测序。

1.2.2 文库质检和测序。将上述检验合格的cDNA文库在Illumina平台进行测序，首先过滤原始数据中低质量、末端质量低、含测序引物的reads，得到clean reads，然后再进行de novo拼接，最后通过CAP3软件拼接来获得最终Unigene序列集合［6］。cDNA 文库构建与测序由生工生物工程（上海）股份有限公司协助完成。

1.2.3 转录组数据质控与组装。测序得到的原始数据中含有带接头的、低质量的序列［去除带N碱基的序列；去除reads中的接头序列；reads 3′—5′去除低质碱基（Q值＜20）；reads 5′—3′去除低质碱基（Q值＜20）；去除reads长度小于35 nt的reads及其配对reads］。为了保证信息分析质量，必须对原始数据过滤，得到Clean数据。

1.2.4 基因功能注释和分类。利用BLAST软件［7］将Unigene序列分别与NR（NCBI non-redundant protein sequences）［7］、NT（NCBI non-redundant nucleic acid sequences）［7］、GO（Gene ontology）［7］、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）［8］、KOG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）［9］、Uniprot（universal protein）［10］以及PFAM（protein family）［11］7个数据库进行比对分析，获得Unigene的注释信息，并对基因功能进行分类。获取枫叶鲑胸腺和头肾基因序列与近缘物种基因序列的相似性以及枫叶鲑胸腺和头肾基因的功能信息，并按照分子功能、细胞组分和生物过程3个大类对其进行GO功能分类。此外，还进行了KOG功能分类，同时获得 KEGG代谢通路分析结果。

1.2.5 基于转录组测序的枫叶鲑亲本鉴定和杂种抗病优势分析。通过对转录组测序结果数据进行筛选以及利用BLAST软件进行比对分析，将筛选得到的线粒体DNA（mtDNA）基因序列和基因组基因序列在NCBI数据库中进行比对，分别确定枫叶鲑的母本及父本来源。将筛得到的免疫相关基因序列进行比对分析，探讨枫叶鲑所具有的抗病优势来源。

2 结果与分析

2.1 样本原始数据统计及数据质控 采用双端测序法并经过质量控制后［12］，共获得胸腺的7.29 Gb总碱基数，GC含量为 47.73%，Q30碱基比例平均超过95.33%；共获得头肾的6.30 Gb 总碱基数，GC含量为 48.63%，Q30碱基比例平均超过95.12%。

2.2 转录组拼接结果统计 对测序结果进行组装、拼接［12］，结果表明，胸腺样本共得到358 880条Transcript和169 204条Unigene，Transcript与Unigene的N50分别为1 463和896 bp；头肾样本共得到282 289条Transcript和132 292条Unigene，Transcript与Unigene的N50分别为1 491和918 bp，表明组装完整性较高。