基因编辑快速改良玉米开花期研究

摘要 为获得早熟玉米种质，选择水稻光周期敏感基因Ghd7的同源基因ZmCCT10作为研究目标，利用基因编辑技术针对该基因的CDS区域进行敲除，获得相关材料后，选择其中表型较为明显的2种，进行生育期及植株表型等相关性状的数据调查与分析，发现敲除该基因后，在长日照的情况下，与野生型相比，编辑后的材料明显提前开花，并出现矮化等明显有利性状。ZmCCT10在玉米的开花调控网络中起抑制作用，敲除该基因可明显解除抑制。

关键词 CRISPR/Cas9；ZmCCT10；开花期

中图分类号 S 513  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）03-0096-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.021

Rapid Improvement of Maize Flowering Period by Gene Editing Technology

XING Rui-xia1，2，ZHU Jin-jie2，QI Xian-tao2 et al

（1.College of Life Sciences，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230036;2.Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Abstract In order to obtain early-maturing maize germplasm，the homolog gene ZmCCT10 of rice photoperiod sensitive gene Ghd7 was selected as the research target，and the gene editing technology was used to knock out the CDS region of this gene.After relevant materials were obtained，two of them with relatively obvious phenotypes were selected for data investigation and analysis on related traits such as growth period and plant phenotype.It was finally found that after the gene was knocked out，compared with the wild type，the edited material significantly bloomed ahead of time and exhibited significantly advantageous traits such as dwarfing.ZmCCT10 played an inhibitory role in the flowering regulatory network of maize，and knock-out of the gene could significantly relieve the inhibition.

Key words CRISPR/Cas9;ZmCCT10;Flowering time

作者简介 邢瑞霞（1995—），女，山东济宁人，硕士研究生，研究方向：基因编辑技术改良玉米生育期及抗逆能力。通信作者，教授，博士，从事玉米逆境生物学研究。

收稿日期 2022-03-22

玉米是在全球广泛种植的主要粮食作物之一，也是重要的饲料作物和重要的工业原料。高产、稳产、优质、适宜的生育期、适应机械化一直都是国内外玉米育种的主要目标。生育期作为玉米重要的农艺性状，其改良工作也一直是玉米育种工作的研究热点。玉米起源于热带的墨西哥西南部，由大刍草驯化而来，对光周期敏感，并需要在短日照条件才能开花［1］，利用基因编辑技术减少玉米植株对光周期的敏感性及改良玉米的开花期在农业生产上有着重要意义。适当缩短生育期不仅能够扩大其种植范围，提高复种指数，而且可以有效降低遭遇抽雄扬花期的高温危害、灌浆后期早霜危害、成熟期雨季穗发芽以及晚期病虫害等的概率。

ZmCCT10（Zm00001eb418700）位于玉米的10号染色体，属于玉米中的CCT家族，与水稻光周期反应调节因子Ghd7同源，同源性在36%左右，其编码的蛋白质含有保守的CCT结构域，作为转录因子微量调节开花开关基因ZCN8的表达，进而影响玉米生育期［2-5］。笔者以基因编辑ZmCCT10基因玉米T6代纯合突变体系以及亲本KN5585自交系为试验材料，在短日照（海南）、长日照（北京）地区进行种植，通过对植株开花期及其他农艺性状的观察，研究ZmCCT10突变对于生育期的影响，以期为进一步探索通过改良开花期进而达到稳产、增产的目的提供了新方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

ZmCCT10基因来自玉米本身的内源基因，通过基因测序获得转化受体KN5585的CDS序列后，进行sgRNA的设计，构建CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌转化后获得转基因材料，经过多代自交获得不含有转基因元件的基因编辑材料，繁殖至T6代ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA株系；亲本对照自交系KN5585，由未米生物科技（江苏）有限公司提供。

1.2 Cas9基因编辑敲除载体构建 以KN5585为背景材料，其基因序列与B73略有差别。通过测序获得ZmCCT10的CDS序列后，在http：//crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR？tdsourcetag=s_pctim_aiomsg网站中设计sgRNA，为保证编辑效率，一般选择5′G—NGG3′的sgRNA，再利用https：//www.gramene.org/网站进行BLAST后选取特异性较高的sgRNA，构建可以通过胚荧光筛选的单sgRNA-Cas9敲除的基因编辑载体。

基因编辑基础载体CPB-Cas9（已连入Ubiquitin启动子驱动的Cas9表达盒）由中国农业科学院谢传晓课题组提供，加入荧光筛选系统快速辨别籽粒阴阳性。荧光筛选系统采用胚特异性启动子ZmESP启动RFP荧光蛋白。

1.3 转化鉴定与基因型鉴定

将构建好的基因编辑敲除载体送至未米生物科技（江苏）有限公司进行农杆菌转化，获得转基因材料。收获的种子经过荧光筛选后，挑选阳性籽粒进行种植，进行ZmCCT10靶基因突变鉴定获得转基因材料，并将突变的材料进行自交，从收获的籽粒中选择选阴性籽粒进行种植，直至获得纯合无转基因元件的突变体材料。

待T6代ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA株系成长到3叶期，采用CTAB法提取其叶片DNA后进行Cas9 PCR检测、Bar PCR检测及Bar试纸条检测，确定ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA为无转基因元件株系，再进行靶基因检测，PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，利用SnapGene及DNAMAN进行序列比对确定其基因型。所需检测引物序列见表1，检测程序见表2。

1.4 纯合材料表型调查方法

将稳定且纯合的无转基因ZmCCT10-1IT、ZmCCT10-1IA株系以及亲本对照KN5585种植在短日照的海南乐东黎族自治县、长日照的北京南口中国农业科学院试验基地2个地区，经纬度分别为109.17°E，18.7°N和116.2°E，40.2°N，并调查花期和植株农艺性状，具体调查指标及方法见表3，探究ZmCCT10基因对于玉米生育期的影响。

1.5 数据统计

数据取样本量的平均值，经过Excel整理及初步分析后，用SigmaPlot 14.0进行统计分析，数据差异显著采用经典T检验计算，**表示P<0.01极显著差异，*表示P<0.05显著差异，P>0.05表示无显著差异。

2 结果与分析

2.1 Cas9基因编辑敲除载体图谱

U6启动单sgRNA的荧光敲除载体图谱如图1所示，命名为CPB-Cas9-ZmCCT10。用E35S启动子Bar的表达，可在真核生物中检测是否含有该载体；UBI强启动子启动作为编辑器的Cas9，保证Cas9蛋白的高表达；胚特异性启动子ZmESP启动RFP表达，阳性籽粒可在波长为520 nm的绿色激发光下配以LUV-50A红色眼镜进行观察，阳性籽粒会发出明亮的红光，阴性籽粒则不发光；U6-2启动sgRNA。

2.2 无转基因元件鉴定以及基因型鉴定

将构建好的载体送至未米生物科技（江苏）有限公司进行转化，T0获得42个植株，经过转基因元件Bar和Cas9检测后，获得23株阳性植株，占比54.76%，获得5种转化事件，挑选其中2种移码突变材料继续进行生育期研究。根据其突变类型将这2种株系分别命名为ZmCCT10-1IT株系及ZmCCT10-1IA株系。在后代中，分离出无转基因元件且含有目标突变的纯合突变单株，自交繁种。选用T6代遗传稳定的无转基因元件材料。

将所需检测植株进行转基因元件检测以及靶基因检测，图2a为Bar检测及试纸条检测结果，以载体转化的农杆菌作为阳性对照，野生型作为阴性对照，水作为空白对照，对目标植株进行Bar检测，阳性植株检测出符合大小的目的条带，阴性植株及阴性对照、空白对照均未检测出条带，鉴于Bar检测容易出现污染，同时使用Bar试纸条进行蛋白水平的检测，2种检测结果一致；图2b为Cas9检测结果，对照同Bar检测，阳性植株检测出符合大小的目的条带，阴性植株及阴性对照、空白对照均未检测出条带；图2c为靶基因检测结果，以载体质粒作为阴性对照、水作为空白对照以及野生型作为阳性对照，2种突变体株系均检测符合大小的目的条带。

将测序后的靶基因序列利用DNAMAN及SnapGene进行比对，确定突变株系的突变类型，如图3a所示，ZmCCT10-1IT株系在PAM上游第4位发生了一个加1T的插入；如图3b所示，ZmCCT10-1IA株系在PAM上游第4位发生了一个加1A的插入，均引起移码突变。根据检测得到的序列，利用DNAMAN软件对靶基因蛋白进行预测，如图4a和4b所示，2种移码突变均能够引起蛋白的提前终止。

2.3 纯合突变体株系ZmCCT10-1IT和ZmCCT10-1IA对开花期的影响

将阴性纯合突变株种植到海南和北京，种植模式为4 m行长，17株，株间距25 cm，行间距60 cm，按每行成活情况观察各株系抽雄期、散粉期、吐丝期等与开花相关的表型，并进行数据统计与分析。如图5a、5b、5c所示，在海南短日照地区，ZmCCT10-1IT株系与野生型相比，抽雄期提前3 d，散粉期提前4 d，吐丝期提前2 d，统计结果表明差异极显著；ZmCCT10-1IA株系与野生型相比，抽雄期提前1 d，散粉期与野生型一致，吐丝期推迟1 d，抽雄期和吐丝期差异显著。

如图5d、5e、5f所示，在北京长日照地区，ZmCCT10-1IT株系与野生型相比，抽雄期提前2 d，差异极显著，散粉期提前2 d，差异显著，吐丝期提前3 d，差异极显著；ZmCCT10-1IA株系与野生型相比，抽雄期提前1 d，差异显著，散粉期提前3 d，差异显著，吐丝期提前5 d，差异呈极显著。由此可知，无论是在短日照还是在长日照地区，ZmCCT10基因对于玉米的开花期均有影响，敲除该基因能有效提前花期，且在长日照地区更为明显，说明ZmCCT10在长日照条件下充当玉米的开花抑制因子。

农艺性状是该研究考察的另一大重点。如图6a、6b、6c所示，在海南短日照地区，ZmCCT10-1IT株系与野生型相比，株高降低18.6 cm，去雄株高降低15.2 cm，穗位高降低24.3 cm，差异均达极显著水平；ZmCCT10-1IA株系与野生型相比，株高降低9.4 cm，去雄株高降低10.9 cm，穗位高降低0.8 cm，且均呈极显著相关。如图6d、6e、6f所示，在北京长日照地区，ZmCCT10-1IT株系与野生型相比，株高降低21.7 cm，去雄株高降低21.5 cm，穗位高降低22.8 cm，且差异均呈极显著；ZmCCT10-1IA株系与野生型相比，株高降低16.3 cm，差异极显著，去雄株高降低17.0 cm，差异显著，穗位高降低8.7 cm，差异极显著。植株整体表型如图7所示。