基于Cytb基因的穿山甲科物种鉴定研究

摘要 为鉴别混有非穿山甲物种疑似检材的来源物种，基于细胞色素b基因设计了穿山甲科特异的新引物 DCW-F1/DCW-R1。试验表明：其特异性良好、灵敏度较高、适用检材类型较广。采用BLAST比对法、遗传距离法和系统发育法分析了4组不同长度Cytb序列，研究序列长度对穿山甲物种鉴定的影响。结果表明，多数样本与相应穿山甲物种同源序列相似度均高于98%，建议将该值作为BLAST比对法的判别标准；除马来穿山甲（211 bp）和树穿山甲（421和 211 bp）外，剩余5个穿山甲物种种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离，序列长度的变化和样本量的不平衡会导致该比值不稳定；除马来穿山甲和菲律宾穿山甲，其余物种均为单系，序列长度变短使得系统发育树拓扑结构和分支置信度发生相应变化。

关键词 物种鉴定；穿山甲；细胞色素b基因（Cytb）；序列分析

中图分类号 S 863  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）03-0089-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.020

Species Identification for Pangolins Based on Cytochrome b Gene

WANG Chen1，YANG Ya-fu1，LI Li2 et al

（1.College of Wildlife and Natural Reserve， Northeast Forestry University， Harbin，Heilongjiang 150040;2.Hunan Biodiversity Conservation Center， Changsha，Hunan  410000）

Abstract A pair of new specific primers DCW-F1/DCW-R1 were designed based on Cytochrome b （Cytb） gene to identify suspected specimens mixed with non-pangolin species.The results showed that it was good specificity， high sensitivity and could be used for several type samples.Secondly， we used BLAST comparison， genetic distance and constructing phylogenetic tree to analyze the four groups of Cytb sequences with different lengths， in order to estimate the influence of changing sequence length on pangolin identification.The results indicated that the similarity of homologous sequence between most samples and corresponding pangolin was higher than 98%.This suggested that the value should be used as the criterion to identify pangolin species.The minimum inter-specific genetic distance （inter-d） was greater than the maximum Intra-specific genetic distance （intra-d） among five pangolins with the exception of M.javanica （211bp） and P.tricuspis （421 and 211 bp）.The variation of sequence length and the imbalance of sample size could cause unstable ratio.Phylogenetic trees showed that most pangolin species except M.javanica and M.culionensis were monophyletic， and their topological structure and confidence for some nodes changed with the sequence being shorter.

Key words Species identification；Pangolin；Cytochrome b；Sequence analysis

基金项目

珍稀濒危物种调查监管与行业规范项目（2020070209-4）；湖南省林业科技创新计划项目（XLK201915）。

作者简介 王辰（1997—），男，天津人，硕士研究生，研究方向：分子生物学。通信作者，副教授，从事动物遗传育种与繁殖研究。

鸣  谢 试验样本的采集得到了国家林业和草原局野生动植物检测中心徐艳春教授、金煜教授、白素英副教授等的大力支持与帮助，在此一并致谢。

收稿日期 2022-03-22

穿山甲是哺乳纲（Mammalia）鳞甲目（Pholidota）穿山甲科（Manidae）动物的统称。现存3属8种：穿山甲属（Manis）的中华穿山甲（M.pentadactyla）、印度穿山甲（M.crassicaudata）、马来穿山甲（M.javanica）和菲律宾穿山甲（M.culionensis）；地穿山甲属（Smutsia）的南非穿山甲（S.temminckii）和大穿山甲（S.gigantea）；长尾穿山甲属（Phataginus）的树穿山甲（P.tricuspis）和长尾穿山甲（P.tetradactyla），分布于亚洲和非洲的热带和亚热带地区［1-6］。

穿山甲因有食用和药用价值而遭到人类的乱捕滥猎，加之生境被破坏及外来物种入侵等因素，其野生种群数量急剧下降，甚至面临灭绝［7-8］。2016年10月，CIETS缔约国大会通过“所有8种穿山甲物种由附录II 提升至附录 I”的提案［9-10］。由此，为打击穿山甲的非法贸易需要选择合适的分子标记、构建标准的物种鉴定方法。

线粒体基因组作为“扩展条形码”［11］，常用于物种鉴定和系统发育关系评估［12-13］。该技术成本较为昂贵，不适合在穿山甲非法贸易频发的东南亚和非洲国家推广使用。线粒体细胞色素b（Cytochrome b，Cytb）基因进化速率适中、含有丰富的遗传信息、结构清晰，被广泛地应用于物种鉴定［14］。目前，基于Cytb基因的穿山甲物种鉴定多是利用脊椎动物或哺乳动物通用引物，所扩增的序列长度长短不一［15-18］。研究表明，利用穿山甲科特异引物可以有效排除非目标物种的干扰［15］，Cytb基因序列长度变化可能影响鉴定结果的判读［19］。由此，笔者依据Cytb基因设计了穿山甲科物种鉴定的特异引物，并评估4种长度的Cytb基因序列对穿山甲物种鉴定的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 收集191份穿山甲样品。其中，174份为已知马来穿山甲样本，包括128份肌肉样，18份皮肤样，12份粪便样，7份毛发样，9份鳞片样，剩余17份样本为未知穿山甲样本，其中包括1份疑似穿山甲鳞片粉末（表1）。利用

智人（Homo sapiens ， n=3）、貉（Nyctereutes procyonoides ， n=3）、朱顶雀（Acanthis flammea ， n=3）、东北兔 （Lepus mandshuricus ， n=1）、牛（Bos taurus ， n=1）、虎（Panthera tigris ， n=1）、家猪（Sus scrofa domestica ， n=1）的DNA作为非穿山甲物种对照样本。上述样本均来自国家林业和草原局野生动植物检测中心样本库。样品采集后于-20 ℃冰箱内保存。同时，从NCBI上下载135条序列穿山甲物种（表1）和部分非穿山甲物种的Cytb基因同源序列用于引物设计和序列综合分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取。

穿山甲鳞片用75%乙醇清洗表面，经灭菌去离子水清洗、风干后剪取其表面残留的皮肤组织或毛发，或钻取鳞片粉末。将皮肤、毛发及鳞片粉末分别装入1.5 mL离心管。将肌肉样剪碎后置于1.5 mL离心管。使用AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit试剂盒（爱思进）提取肌肉、毛发、皮肤及鳞片的总DNA。另外，称取180～220 mg的粪便使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒（爱思进）提取总DNA。DNA提取步骤均参考试剂盒说明书，DNA原液存放于-20 ℃冰箱。

1.2.2 引物设计。

利用Primer PREMIER 6.0软件基于马来穿山甲Cytb全序列设计穿山甲科特异PCR引物。引物搜寻参数包括：熔解温度（Tm）为60 ℃、引物长度（Length）为18～30 bp、扩增产物长度（amplication length）为70～200 bp，余下参数为默认值。使用MEGA 5.0中的BLAST程序筛选满足设计原则的引物，参考的非穿山甲物种的同源序列包括：兔形目的穴兔（Oryctolagus cuniculus，HQ596486、KT626640）、食肉目的土狼（Canis latrans，KT447695～KT447698）和家犬（Canis lupus familiaris GU249573、MH714782～MH714784、KJ660981、KJ660982）、翼手目的蝙蝠（Ardops nichollsi，KJ024748～KJ024751）、偶蹄目的牛（Bos taurus，KT626620）、贫齿目的犰狳（Dasypus novemcinctus，KU253494、KT626619、KT626620）和灵长目的智人（Homo sapiens，JN034134 ～JN034136）。

1.2.3 PCR扩增和测序。

利用3对引物：L14724/H15149［26］、mcb398/mcb869［27］、DCW-F1/DCW-R1分别扩增穿山甲科自有样本（表1）Cytb基因部分序列。反应体系均为50 μL：5 μL DNA模板，0.5 μL上、下引物，25 μL DNA 聚合酶（Transgen，北京），19 μL灭菌去离子水。PCR在PE9700型DNA扩增仪（PE，美国）进行。L14724/H15149反应条件为：预变性95 ℃/5 min（变性95 ℃/30 s，退火56 ℃/30 s，延伸72 ℃ 1 min），循环40次，延伸72 ℃ 5 min；mcb398/mcb869反应条件为：预变性94 ℃ 5 min（变性94 ℃ 1 min，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s），循环35次，延伸72 ℃ 10 min； DCW-F1/DCW-R1反应条件为：预变性94 ℃ 5 min，（变性94 ℃ 1 min，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s），循环35次，延伸72 ℃ 10 min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京擎科生物技术有限公司哈尔滨分公司利用ABI3730XL DNA测序仪进行双向测序。同时将DNA浓度 ≥25 ng/μL的样本送至深圳华大基因科技有限公司，通过鸟枪法构建文库，使用Illu mina HiSeq2500测序仪进行高通量测序。

1.2.4 引物有效性测试。

引物特异性测试使用NCBI/Primer-BLAST程序验证引物DCW-F1/DCW-R1与GenBank 数据库中非目标物种的结合情况。然后使用7个非穿山甲物种的DNA样品进行实证试验。最后开展混合样品试验，将上述7个物种的DNA样本按浓度均匀混合，再分别与3种不同类型（肌肉、粪便和鳞片）的穿山甲物种DNA抽提液混合，浓度比为1∶1，分别进行PCR扩增及测序。