单环刺螠体腔液细胞的流式分布及抗菌活性研究

摘要 通过不连续密度梯度离心结合流式细胞术对单环刺螠体腔液细胞进行聚类，并对体腔液细胞抗菌活性进行测定。结果表明：利用流式细胞术将不连续密度梯度离心获得的Percoll各细胞层与全部的体腔液细胞对比，将单环刺螠体腔液细胞聚为3个亚群，分别为白色透明细胞、红色颗粒细胞和半颗粒细胞。体外试验发现，单环刺螠体腔液细胞具有一定的抑菌/杀菌能力，可以减少大肠杆菌引发的溶血现象，能通过呼吸爆发的方式抑制大肠杆菌的生长，抑菌率为22.36%；但其对枯草芽孢杆菌的抑制效果甚微。单环刺螠体腔液细胞分类及抗菌活性的研究有助于丰富单环刺螠基础生物学内容，完善单环刺螠的育苗、养殖的基础理论体系。

关键词 单环刺螠；流式细胞术；抗菌活性；呼吸爆发

中图分类号 S 917.4  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）03-0084-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.019

Study on the Flow Distribution and Antibacterial Activity of Urechis unicinctus Coelomocytes

HUANG Dong1，2，YANG Lin-tong2，3，JIAO Xu-dong2 et al

（1.Agronomy College，Ludong University， Yantai， Shandong 264025;2.Yantai Coastal Zone Research Institute， Chinese Academy of Sciences， Yantai， Shandong 264003;3.College of Life Sciences，Yantai University， Yantai， Shandong 264005 ）

Abstract By the inconsequential density gradient centrifugation cominbed with flow cytometry， the coelomocytes were clustered， the antibacterial activity of coelomocytes was determined. The results showed that the cell layer obtained by Percoll discontinuous density gradient centrifugation was compared with all the coelomocytes by using flow cytometry， the coelomocytes were clustered into three subgroups， namely white hyalinocyte， red granulocyte and semi granular cells. In vitro experiment results showed that U. unicinctus coelomocytes had a certain bacteriological/bactericidal ability， which could reduce the hemolysis phenomenon caused by E. coli， and inhibit the growth of E. coli by the method of respiratory burst， with the antibacterial rate of 22.36%. The inhibition effect on B. subtilis was minimal. The classification and antibacterial activity study on U. unicinctus coelomocytes was helpful to enrich the basic biological content and improve the basic theoretical system of seedling and breeding of U.unicinctus.

Key words Urechis unicinctus;Flow cytometry;Antibacterial activity;Respiratory burst

基金项目 中国科学院青年创新促进会项目；烟台市海洋经济创新发展示范城市项目（YHCX-SW-L-202004）；烟台市科技发展计划项目（2021YT06000426）。

作者简介 黄栋（1995—），男，重庆人，硕士研究生，研究方向：海水养殖及综合利用。通信作者，讲师，从事海岸带生物资源及开发利用研究。

收稿日期 2022-03-22

据推测，海洋无脊椎动物占海洋中动物总量的90%以上［1］，大部分种类动物体内的体腔液或血液细胞尚未明确功能。目前普遍认为体腔液细胞是海洋无脊椎动物天然免疫防御系统的重要组成部分，具有清除感染［2］、吞噬异物［3-4］、分泌免疫因子（如C1q凝菌因子［5］、凝集素［6］、棘色素-A［7-8］等）、修复创伤组织［9］等功能。

海洋无脊椎动物体腔液或血细胞尚缺乏统一的分类标准［10］。在部分贝类［11-13］、虾类［14］、螃蟹［15-16］血液细胞的研究中，透明细胞（hyalinocyte）和颗粒细胞（granulocyte）被认为是普遍存在的主要细胞类群。刘东武等［11］和许秀芹等［12］将中国蛤蜊、太平洋牡蛎等8种常见双壳贝类的血淋巴细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞和透明细胞；李光友等［14］和Martin等［15］将中国对虾和2种单肢虾的血淋巴细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞及透明细胞。Bodammer［16］和胡锦丽等［17］将蓝蟹和中华绒螯蟹的血淋巴细胞分为颗粒细胞、透明细胞及半颗粒细胞。

单环刺螠（Urechis unicinctus）是环渤海及北太平洋区域特有的一种海洋低等无脊椎动物。作为一种新兴的养殖品种，它具有较高的营养和经济价值［18-19］。单环刺螠无心脏、血管等循环系统分化，推测其体腔液及体腔液细胞具有营养物质输送、免疫防御等功能。目前对单环刺螠的研究较少。笔者利用密度梯度离心结合流式细胞术对单环刺螠体腔液细胞进行聚类分析，并对其体腔液细胞的抗菌/杀菌活性进行测定，旨在为单环刺螠育苗养殖过程中的病害防控提供基础理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

购买市售活力较强、体表无明显损伤的单环刺螠，平均体重（25.36±5.12）g；置于50 L海水暂养池暂养7 d，池底铺设15～20 cm洁净海沙，温度18～20 ℃，适量曝气，不饲喂。

1.2 体腔液细胞的流式分布

随机取单环刺螠3只，先用70%乙醇擦拭体表消毒，将含EDTA-2K（0.1 mg/mL）的无菌注射器沿身体纵向刺入，抽取1 mL红色体腔液并混匀。用无菌PBS缓冲液按说明书配制Percoll工作液，在10 mL离心管中依次加入浓度40%、35%、26%、20%、16%的1 mL Percoll工作液，形成不连续密度梯度。在最上层加入1 mL体腔液，4 ℃、2 500 r/min离心30 min［20-21］。离心结束后小心将形成的细胞层分别吸出并收集备用。

取不同梯度离心层，使用流式细胞仪FACSAria（美国BD，Becton Dickinson）进行检测，检测前向角散射光（forwardscatter，FSC）和侧向角散射光（sidescatter，SSC）。试验数据使用CELL Quest软件处理。获取细胞数为10 000个，分别以FSC和SSC为横、纵坐标绘图，从门水平上圈出各个细胞亚群。

1.3 样品预处理

1.3.1 细菌悬浊液的制备。

从-80 ℃冰箱中取出实验室保存的枯草芽孢杆菌（ATCC W0825）、大肠杆菌（ATCC 25922）菌种，分别接种至5 mL LB液体培养基中，37 ℃摇床培养过夜。将菌液5 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用PBS洗涤，上述步骤重复3次，再用PBS重悬，并调节细菌浓度至1×107 CFU/mL，备用。

1.3.2 体腔液细胞的制备。

用0.1 mg/mL肝素钠浸润后的1.5 mL无菌注射器从海肠体腔中采集1 mL体腔液，将体腔液于4 ℃、1 500 r/min下离心30 min，弃上清，沉淀用无菌生理盐水（0.9 g NaCl，100 mL H2O）洗涤，上述步骤重复3次，再用L-15液体培养基重悬，并调节细胞浓度至1×106 CFU/mL，备用。

1.4 溶血试验

参照秦真东［22］的方法测定枯草杆菌和大肠杆菌对体腔细胞的溶血情况。取0.5 mL的体腔细胞溶液，分别与0.5 mL枯草芽孢杆菌和大肠杆菌悬液混匀，室温孵育，分别于孵育后不同时间点取样，3 800 r/min 离心5 min后取200 μL上清液加到96孔酶标板中，置于酶标仪404 nm处检测吸光值。

1.5 抗菌活性测定

1.5.1 呼吸爆发水平测定。

1.5.1.1 活性氧（ROS）水平的检测。

参照单环刺螠呼吸肠ROS检测的方法［23］，取0.5 mL单环刺螠体腔细胞悬液与0.5 mL终浓度1×105 CFU/mL 的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌悬液混匀，28 ℃孵育 30 min。按1‰比例加入DCFH-DA探针，37 ℃、80 r/min下避光孵育60 min。4 ℃、3 400 r/min下离心10 min，用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，重悬后置于96孔荧光酶标板。使用荧光酶标仪（Fluoroskan Ascent FL，Thermo）设置激发波长488 nm、发射波长525 nm，检测吸光值。

取0.5 mL单环刺螠体腔细胞悬液分别与0.5 mL不同浓度（1×105～3×105 CFU/mL）的大肠杆菌悬浊液混合，按照同样方法测定吸光值。

1.5.1.2 一氧化氮水平的测定。

参照张梦兰等［24］对一氧化氮的检测方法，将单环刺螠体腔液细胞悬液与枯草芽孢杆菌、大肠杆菌（终浓度为1×107 CFU/mL）按体积比1∶1加入96孔酶标板中，各50 μL。28 ℃孵育30 min；加入100 μL gress A，37 ℃孵育10 min后再加入100 μL gress B，37 ℃孵育10 min后，使用酶标仪检测540 nm处的吸光值。

取50 μL单环刺螠体腔细胞悬液分别与50 μL不同浓度（1×107～3×107 CFU/mL）的大肠杆菌悬浊液混合，按上述同样方法测定吸光值。

1.5.2 抗菌活性测定。

参照Du等［25］的方法将1 mL单环刺螠体腔细胞悬液分别与枯草芽孢杆菌和大肠杆菌（1×105 CFU/mL）28 ℃温育60 min。先将处理后的混合液进行10倍稀释，再涂布于LB固体培养基表面，28 ℃过夜培养后计算平皿上细菌菌落数量。以生理盐水作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 体腔液细胞分布

前期采用显微观察的方法分析单环刺螠体腔液细胞分布，发现单环刺螠体腔液细胞主要由红色颗粒细胞、白色透明细胞等构成。

利用Percoll不连续密度梯度离心可将单环刺螠体腔液细胞主要分为3层（图1）：红色颗粒细胞主要集中在20%～26%的Percoll工作液中；20%的Percoll工作液以近圆状、细胞内充满颗粒的红色细胞为主，内含少量无色透明细胞；26%的Percoll工作液以近圆状、充满颗粒的红色细胞为主，含少量的透明细胞；白色透明细胞主要分布在16%和35%～40%的Percoll工作液。16%的Percoll工作液以小型近圆状透明细胞为主，同时含有少量的红色颗粒细胞；35%和40%的Percoll工作液多为近圆状、大透明细胞及极少数红色颗粒细胞。