蛹虫草对LPS诱导的小鼠氧化应激的保护作用

摘要 ［目的］利用脂多糖（LPS）诱导急性氧化应激损伤，评价蛹虫草对机体氧化和抗氧化系统平衡的保护作用。［方法］KM系小鼠分别腹腔注射6、8、10 mg/kg LPS水溶液0.5 mL/只（n=5），确定LPS诱导氧化应激的最佳剂量和时间效应。试验组以推荐剂量0.61 mg/g的蛹虫草水溶液，对照组为同等剂量蒸馏水，连续灌胃28 d后，腹腔注射10 mg/kg LPS的2、4、6、8 h取材（n=5），分别记录饮食、饮水及脏器指数变化。［结果］10 mg/kg LPS引起的小鼠扎堆、精神萎靡、嗜睡、竖毛及腹泻等应激症状最为稳定。对照组在LPS注射后肝脏、肾脏、脑组织均出现T-AOC指数和CAT活性的急剧下降，MDA和H2O2含量明显增加，试验组各指标变化趋势较为温和，并早于对照组恢复至空白组水平。［结论］短时间内连续服用蛹虫草可以降低LPS诱导的氧化应激损伤，作为天然抗氧化添加剂具有一定的开发潜力。

关键词 蛹虫草；脂多糖；氧化应激；保护作用

中图分类号 R 285  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）03-0171-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.039

Protective Effect of Cordyceps militaris on LPS-induced Oxidative Stress in Mice

WANG Jia-ni1，YU Kai-wen1， XU Fang-xu2 et al

（1.College of Life Science， Shenyang Normal University， Shenyang，Liaoning 110034; 2.Experimental Teaching Center， Shenyang Normal University， Shenyang，Liaoning 110034）

Abstract ［Objective］To evaluate the protective effect of Cordyceps militaris on the balance of oxidative and antioxidant systems by lipopolysaccharide （LPS） induced acute oxidative stress injury.［Method］ KM mice were intraperitoneally injected with 6， 8 and 10 mg/kg LPS aqueous solution 0.5 mL/animal （n=5）， which determined the optimal dose and time effect of LPS induced oxidative stress.Then the experimental group was treated with 0.61 mg/g Cordyceps militaris aqueous solution and the control group was treated with distilled water.After continuous gavage of 0.5 mL/animal for 28 days， samples were collected at 0， 2， 4， 6 and 8 hours after intraperitoneal injection of 10 mg/kg LPS （n=5）.The changes of diet， drinking water and organ index were recorded.［Result］10 mg/kg LPS caused the most stable stress symptoms in mice， such as pile up， depression， drowsiness， bristling and diarrhea.After LPS injection， T-AOC index and CAT activity of liver， kidney and brain tissues in the control group decreased sharply， and MDA and H2O2 content increased significantly.The change trend of each index in the test group was relatively mild， and recovered to the level of the blank group earlier than that in the control group.［Conclusion］Continuous administration of Cordyceps militaris in a short period of time can reduce LPS induced oxidative stress injury， which has certain development potential as a natural antioxidant additive.

Key words Cordyceps militaris;Lipopolysaccharide;Oxidative stress;Protective effect

基金项目 辽宁省科技厅农村科技特派员工作团专项（20-207-3-47）。

作者简介 王佳妮（1997—），女，辽宁沈阳人，硕士研究生，研究方向：微生物制药。通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事微生物制药研究。

收稿日期 2022-07-07

氧化应激（oxidative stress，OS）这一概念最早由衰老研究权威Sohal教授在1985年提出。正常情况下，生物体处于氧化与抗氧化的动态平衡状态，受到有害刺激时，体内的活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）或活性氮自由基（reactive nitrogen species， RNS）会大量产生和蓄积，进而对生物大分子活性、细胞结构产生严重的破坏［1］，引起复杂的生理或病理损伤过程，如糖尿病、高血压、肝病、癌症等［2-4］。近年来，人工合成的抗氧化剂因其安全隐患备受争议，如过量使用会引起致畸、癌变以及一些慢性疾病等危害，从天然生物资源中寻找有效的抗氧化物质用于维持人体及动物健康成为新的研究焦点［5］。

蛹虫草［Cordyceps militaris（L.ex Fr.） Link.］分类学上属麦角菌科、虫草属，是我国传统的食药两用真菌。研究显示，蛹虫草具有丰富的、非营养素类的抗氧化活性成分，其体外抗氧化活性得到了较为广泛的解读［6-8］。其中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是抗氧化酶系的重要组成成员，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，蛹虫草含有真核生物超氧化物歧化酶全部种类的同工酶Cu-SOD、Zn-SOD、Mn-SOD和 Fe-SOD［9］，且具有热稳定性高、酶活不受pH影响等优势［10］。此外，蛹虫草黄色素对1，2-二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）具有很好的清除效果，其黄色素YP1、YP2和YP3的抗氧化效果与抗氧化剂VC相当。虫草烯是一种分子量大小为263.115 8 m/z的新型蛹虫草黄色素，2 mg/mL虫草烯的DPPH自由基清除活性与VC接近，可以提高老化HSF细胞的SOD、过氧化氢酶（CAT）活性，并降低丙二醛（MDA）水平［11］。此外，蛹虫草多糖对DPPH自由基和羟自由基亦具有显著的清除能力［12］。因此，该试验利用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导小鼠急性氧化损伤，评价日常服用蛹虫草对机体氧化应激损伤的保护作用，为蛹虫草作为天然抗氧化类功能性食品的应用潜质提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。SPF级KM小鼠，雌雄各半，体重18～20 g，于室温（24±2）℃、湿度（55±5）%，自然光照条件下饲养，小鼠及维持鼠粮均购自辽宁长生生物技术有限公司。蛹虫草子实体由沈阳师范大学功能性蛹虫草省重点实验室栽培提供，60 ℃烘干至恒重，粉碎机粉碎，过80目筛网，-20 ℃储存备用。灌胃前以蒸馏水配制成工作液使用。

1.1.2 试剂。脂多糖（Sigma）、过氧化氢测试盒（分光光度法）、总抗氧化能力测试盒（ABTS法）、丙二醛测试盒（TBA法）、过氧化氢酶测试盒（ABTS法），均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器。电子天平（上海精密仪器有限公司）；台式低温离心机（上海湘怡离心机仪器有限公司）；-80 ℃超低温冰箱（日本SANYO公司）；酶标仪（北京普天新桥技术有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 LPS氧化应激损伤模型的确立。

KM小鼠随机分为模型组和空白组，模型组腹腔注射0.5 mL/只LPS水溶液诱导氧化应激损伤，分别为6 mg/kg LPS组、8 mg/kg LPS组、10 mg/kg LPS组（n=5），空白组注射同等剂量无菌水。记录小鼠被毛、精神、运动和粪便情况，LPS注射前和注射24 h后小鼠体重记为W1和W2， LPS注射24 h后脱颈处死解剖，称取小鼠肝脏、肾脏、脾脏、胸腺重量，分别计算脏器指数和失重率（QW），计算方法如下：

脏器指数=脏器重量（mg）/体重（g）×100%

QW=［W1（g）-W2（g）］/W1（g） ×100%

1.2.2 蛹虫草的氧化应激保护作用。

1.2.2.1 试验分组及处理。

KM小鼠随机分为空白组、对照组和试验组（n=30），基于蛹虫草推荐使用剂量标准0.03 g/kg，根据Meeh-Rubner公式得出小鼠基础使用剂量为0.61 mg/g，试验组以0.5 mL/只蛹虫草水溶液连续灌胃28 d；空白组和对照组灌胃同等剂量蒸馏水；对照组及试验组于最后一次灌胃1 h后，腹腔注射10 mg/kg LPS诱导氧化应激损伤。

1.2.2.2 小鼠基础生理状态的观察。

每日观察记录各组小鼠精神状态、饮水量及进食量。于LPS注射0、2、4、6、8 h，分别处死各组小鼠（n=6），称取肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、全脑重量，PBS缓冲液清洗后，装入EP管，-80 ℃冰箱冻存待用，并计算脏器指数。

1.2.2.3 氧化应激指标的定量检测。称取肝脏、肾脏、脑组织0.5 g，加入9 倍体积0.9%的生理盐水，冰上匀浆，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min，收集组织液。按照各试剂盒说明书要求进行相关指标的检测，其中，采用考马斯亮蓝蛋白法测定各组织的总蛋白含量，比色法检测各组织总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢（H2O2）含量，检测波长为405 nm。硫代巴比妥酸法测定各组织的MDA含量，检测波长为532 nm。紫外法测定各组织的CAT活性，检测波长为405 nm。各检测组均为3复孔。

1.3 数据处理 试验数据采用Excel 2016软件进行整理，采用IBM SPSS Statistics 22.0软件，单因素方差分析法对数据进行统计分析，数据以±S表示，以P<0.05为差异有统计学意义。