基于SPME结合GC-MS法测定霉变烟叶中挥发性成分的研究

摘要 ［目的］采用SPME富集霉变烟叶的挥发性成分，再用GC-MS对挥发性成分进行分离和鉴定，建立测定霉变烟叶挥发性代谢成分的方法。［方法］对影响SPME的因素（萃取头种类、萃取温度、萃取时间和解吸附时间）进行了优化，得到较优的萃取条件，并对方法的重现性进行考察；在上述条件下对样品进行测定，并对所筛选出的挥发性成分进行主成分和聚类分析。［结果］较优的萃取条件：采用固定相为75 μm Carboxen-PDMS涂层的黑头萃取头，在80 ℃下萃取样品50 min，萃取头在气相色谱进样口的解吸附时间为2 min。方法的重现性考察显示，6次测定结果的RSD值小于20%，说明所建立方法具有较好的重现性，满足霉变烟叶中挥发性成分的测定要求。在上述条件下对样品进行测定，从样品中鉴别出醇类、酯类、酮类和醛类等挥发性成分，霉变烟叶与正常烟叶有8种化合物具有明显差别，分别是5-甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、1，2-二甲氧基-苯、2，4-二氯-1-甲氧基-苯、5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃、十六酸甲酯和十六酸。对所筛选出的8种挥发性成分的主成分和聚类分析结果表明，所筛选出的8种挥发性成分可作为烟叶霉变的标记成分。［结论］该方法的开发为烟叶早期霉变的识别及有效预防提供借鉴。

关键词 烟叶；霉变；挥发性成分；固相微萃取；气相色谱-质谱

中图分类号 TS 41+1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）03-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.043

Study on the Determination of Volatile Components in Mildew Tobacco Leaves Based on SPME Combined with GC-MS Method

MO Zheng， YANG Li-li， ZHOU Peng et al

（Hongyun Honghe Tobacco （Group） Co.， Ltd.， Kunming，Yunnan 650231）

Abstract ［Objective］ The volatile components of mouldy tobacco leaves were enriched by SPME， and then separated and identified by GC-MS to establish a method for determining the volatile metabolic components of mouldy tobacco leaves.［Method］The factors affecting SPME （extraction head type， extraction temperature， extraction time and desorption time） were optimized to obtain better extraction conditions， and the reproducibility of the method was investigated;under the above conditions， the samples were determined， and the selected volatile components were subject to principal component and cluster analysis.［Result］Optimum extraction conditions： 75 μm Carboxen-PDMS for stationary phase coated black head extraction head，the sample was extracted at 80 ℃ for 50 min， and the desorption time of the extraction head at the gas chromatography sample inlet was 2 min.The reproducibility of the method showed that the RSD value of six determinations was less than 20%， indicating that the established method had good reproducibility and met the requirements for the determination of volatile components in moldy tobacco leaves.The samples were determined under the above conditions， and the volatile components such as alcohols， esters， ketones and aldehydes were identified from the samples. There were 8 compounds in moldy tobacco leaves that were significantly different from normal tobacco leaves， namely 5-methyl-2-furan methanol， 1-octene-3-ol， benzyl alcohol， 1，2-dimethoxy-benzene， 2，4-dichloro-1-methoxy-benzene， 5-methoxy-6，7-dimethyl-benzofuran， methyl hexadecate and hexadecanoic acid.The results of principal component analysis and cluster analysis of the eight volatile components showed that the eight volatile components could be used as the marker components of tobacco mildew.［Conclusion］ The development of this method can provide reference for identification and effective prevention of tobacco early mildew.

Key words Tobacco leaves;Mildew;Volatile component;Solid phase microextraction （SPME）;GC-MS

基金项目 红云红河烟草（集团）有限责任公司科技项目（HYHH2019-YL01）。

作者简介 莫峥（1988—），男，云南昆明人，工程师，从事原料仓储物流及烟叶霉变防治技术研究。

收稿日期 2022-04-11；修回日期 2022-09-28

烟叶在储存过程中受微生物、温度和湿度等影响极易发生霉变。烟叶霉变使其色泽变暗，香气遗失，吃味变差，刺激性增大，使用价值降低甚至丧失，给烟草加工企业造成经济损失［1］，早期烟叶霉变的快速识别已成为烟草行业亟待解决的关键问题。目前霉变烟叶的研究多集中于烟叶霉变原因探索和预防措施开发，如改变环境温湿度，使霉菌不宜生长等［2-3］，以及研究烟叶霉变微生物［4-6］。但由于烟叶储存堆码的原因，即使控制仓储环境的温湿度，小部分烟叶仍会霉变。烟叶霉变过程中使其挥发性代谢产物（MVOCs）发生变化，因此可通过监测烟叶霉变的挥发性代谢产物来判断烟叶霉变情况。研究显示，采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）方法检测挥发性代谢产物是一种较为理想的技术［7］。此技术在预测烟叶霉变报道甚少［8］，但在其他行业已有应用报道。在玉米霉变研究中采用挥发性成分作为霉变标记物已有报道［4，9］。在谷物霉变研究中已有报道，谷物在储藏过程中醇类［10］、酯类［11］、酮类［12］、醛类［13-14］、脂肪酸［11］等物质的变化可能导致谷物发生霉变或劣变，对谷物品质产生严重影响。因此，测定烟叶霉变前后挥发性成分测定和筛查具有重要意义，可实现烟叶早期霉变的筛查，对烟叶霉变的提前预测和实时监控提供一种技术措施。

该研究采用SPME结合GC-MS技术测定烟叶霉变特征标记物，建立烟叶霉变挥发性成分的测定方法，以期为霉变烟叶的识别及有效预防提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试材

由云南中烟烟叶仓储库中随机抽取4份烟叶（包括2份K326和2份红花大金元烟叶，即K326 1#、K326 2#、红大1#、红大2#），将各烟叶平均分为2份，其中一份用于后续模拟霉病试验，一份自然醇化，共计8份。

1.2 仪器与试剂

7890B-5975B气相-质谱联用仪，美国安捷伦（Agilent）科技有限公司；HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国安捷伦（Agilent）科技有限公司；AB-204电子分析天平，美国梅特勒（Mettler）公司；固相微萃取手柄，美国Supelco公司；75 μm Carboxen-PDMS固相萃取头（黑头）、85 μm PDMS/DVB固相萃取头（白头）、100 μm PDMS固相萃取头（红头）、7 μm PDMS固相萃取头（绿头）、65 μm PDMS/DVB固相萃取头（蓝头）、30 μm PDMS/DVB固相萃取头（黄头），美国Supelco公司；22 mL顶空瓶，美国安捷伦（Agilent）科技有限公司；LIDA加热搅拌台，广东科力达仪器有限公司；LHS恒温恒湿箱，上海一恒科技有限公司；萘，99%，美国百灵威科技有限公司；乙醇，色谱纯，美国迪马公司。萘内标溶液：取0.100 g萘用乙醇自主配制成浓度为100 μg/mL的内标溶液。

1.3 GC-MS条件

1.3.1

气相色谱条件。进样口温度280 ℃，载气为He，流速为1 mL/min；升温程序：初始温度50 ℃（保持2 min），以5 ℃/min升温至140 ℃（保持1 min），再以10 ℃/min升温至280 ℃（保持1 min）。

1.3.2 质谱条件。离子源为EI源，电子能量为70 eV，质量扫描范围为35～350 amu。

1.4 数据检索

采集的质谱数据经NIST标准谱库进行检索并鉴定，采取峰面积归一化法计算各物质的相对含量。

1.5 烟叶样品制备

模拟烟叶自然霉变，将仓储烟叶放在恒温恒湿箱中，在适宜温湿度条件下（温度为28 ℃、相对湿度为60%）进行霉变试验，放置21 d后，得到霉变烟叶。将对应的正常烟叶与霉变烟叶分别置入旋风磨中，粉碎过40目筛，备用。

1.6 试验方法

选取红花大金元同一份正常烟叶为对象；每次称取0.5 g烟叶粉末样品置于22 mL顶空瓶中，同时在顶空瓶中加入10 μL浓度为100 μg/mL的萘作为内标，及时封盖后将顶空瓶放置于加热搅拌台。将萃取头插入GC进样口于300 ℃老化1 h，直至无杂峰出现，并对条件进行优化：①对萃取头种类（黑头75 μm Carboxen-PDMS、黄头30 μm PDMS/DVB、白头85 μm PDMS/DVB、绿头7 μm PDMS）的优化；②对萃取温度（50、60、70、80、90 ℃）的优化；③对萃取时间（30、40、50、60 min）的优化；④对解吸附时间（1、2、3、4 min）的优化。将萃取的挥发性成分在GC进样口进行解吸附后，成分进入气相色谱-质谱联用仪，在“1.3”条件下分离与鉴定，以出峰数目和峰面积总量作为试验条件优化依据。采用NIST标准谱库进行检索，以萘内标作为参考，对挥发性化合物进行相对定量，正常烟叶与霉变烟叶总离子流图见图1所示。

根据优化条件，对不同品种（包括红大和K326）正常烟叶和霉变烟叶中挥发性成分种类进行测定，并采用Excel和SIMCA P+14.0软件对挥发性成分类型及标志性成分进行统计和筛选。

2 结果与分析

2.1 萃取头的选取