基于UPLC-MS/MS同时定量分析半夏不同炮制品中8种潜在毒性成分

摘要 ［目的］建立超高效液相串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分的含量，并分析其潜在毒性成分的差异。［方法］采用UPLC-MS/MS法测定半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分的含量并进行方法学考察。流动相为甲醇-水溶液，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，质谱离子源为电喷雾离子源（ESI），检测模式为多反应监测（MRM），以苦参碱（正离子）和野黄芩苷（负离子）作为内标物。采用多元统计分析方法对8种潜在毒性成分的含量与炮制方法的相关性进行评价。［结果］8种潜在毒性成分在各自范围内线性关系良好（R2≥0.999）。经多元统计分析，样品被聚集为4类，并通过变量权重重要性排序（VIP）发现胆碱、盐酸麻黄碱和原儿茶酸为4类样品间的主要差异成分。［结论］该方法快速、准确、灵敏度高、重现性好，可用于半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分的含量测定，为后续分析提供参考。

关键词 半夏；UPLC-MS/MS；炮制品；毒性成分；含量测定

中图分类号 R 283  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）03-0192-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.044

Simultaneous Quantitative Analysis of 8 Potential Toxic Components in Different Processed Products of Pinellia ternata Based on UPLC-MS/MS

L Yue1，2，3，4， ZHANG Ying-hui1，2，3， SUN Yu-ting1，2，3 et al

（1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， School of Chemistry， Chemical Engineering and Eesource Utilization， Northeast Forestry University， Harbin，Heilongjiang 150040;2. Engineering Research Center of Forestry Biological Agents， Ministry of Education， School of Chemistry， Chemical Engineering and Resource Utilization， Northeast Forestry University， Harbin，Heilongjiang 150040;3. National Local Engineering Center for Ecological Utilization of Biological Resources， School of Chemistry， Chemical Engineering and Resource Utilization， Northeast Forestry University， Harbin，Heilongjiang 150040;4. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Ecological Utilization of Forestry-based Active Substances， Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract ［Objective］To establish an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the simultaneous determination of eight potentially toxic components in Pinellia ternata and its processed products， and to analyze the differences of their potentially toxic components.［Method］The UPLC-MS/MS method was used to determine 8 poential toxic components in different processed products of Pinellia ternata and to conduct a methodological investigation. The mobile phase was methanol-water solution， gradient elution， flow rate was 0.3 mL/min， mass spectrometry ion source was electrospray ionization source （ESI）， detection mode was multiple reaction monitoring （MRM）， matrine （positive ion） and scutellarin （negative ion） was used as the internal standard. The multivariate statistical analysis method was used to evaluate the correlation between the contents of the 8 toxic components and the processing methods. ［Results］The 8 poential toxic components had a good linear relationship within their respective ranges （R2≥0.999）. After multivariate statistical analysis， the samples were clustered into 4 categories， and through variable weighted importance ranking （VIP）， choline， ephedrine hydrochloride and protocatechuic acid were found to be the main differences among the 4 types of samples. ［Conclusion］The method is rapid， accurate， sensitive and reproducible. It can be used for the determination of 8 potential toxic components in Pinellia ternata and its processed products， and provide reference for subsequent analysis.

Key words Pinellia ternata;UPLC-MS/MS;Processed products;Toxic component;Content determination

基金项目 中央高校基本科研业务费专项基金项目（2572015CA06）；林业公益性行业科研专项（201504701）。

作者简介 吕悦（1997—），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：药用植物资源的开发与利用。通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事药用植物资源的开发与利用研究。

收稿日期 2022-03-13；修回日期 2022-05-05

半夏为天南星科植物半夏［Pinellia ternata（Thunb.）Berit.］的干燥块茎，具有镇咳、祛痰、止呕等作用［1］。有研究报道半夏是有毒的，主要表现为强烈的黏膜刺激性（胃、肠道及咽喉）和肝脏损伤。王丽［2］将半夏总生物碱富集物提取出来，发现可导致小鼠肝损伤。中医药研究发现通过炮制可实现中药的减毒增效［3］。因此半夏生品多外用，临床上以炮制品（清半夏、姜半夏和法半夏）为主。清半夏为生半夏经白矾溶液浸泡所得，毒性低，增强化痰作用；姜半夏为生半夏与生姜、白矾同煮晾干所得，毒性已减，止呕作用增强；法半夏为生半夏用甘草、石灰和白矾制后得到，燥性较为和缓，常用于消食化痰［4-5］。经过不同方法炮制后，半夏毒性明显降低，但其主要毒性成分及含量还不是很明确。

半夏中所含化学成分种类很多，其中生物碱类化合物被认为是主要有效成分之一，但部分生物碱是有毒性的［6］。Zhai等［7］采用UPLC/Q-TOF-MS/MS对16份生半夏、制半夏进行分析，初步鉴定了溶血磷脂酰胆碱为特征标记物，溶血磷脂酰胆碱可诱导炎症反应，因此半夏中溶血磷脂酰胆碱的降低是解毒的主要原因之一。据文献报道，尿黑酸［8］、原儿茶酸和原儿茶醛［9］被认为是半夏辛辣味本质，对黏膜具有强烈刺激性。大黄酚是大黄中蒽醌类化合物，有肝脏毒性以及致癌的风险［10］。有研究表明，半夏经炮制后毒性会减弱，这可能与在炮制过程中半夏毒性成分的含量变化密切相关［5］。

目前，半夏的毒性研究主要集中在毒性成分的探析上，但比较炮制前后半夏毒性成分含量变化的研究报道较少。生物碱类成分紫外吸收较弱［11］，常规方法往往难以达到检测目的，因此液质联用法是生物碱类成分测定的首选。该研究通过查阅文献对半夏炮制品的化学成分进行筛选，筛选得到溶血磷脂酰胆碱、盐酸麻黄碱、葫芦巴碱、胆碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸和大黄酚这8种潜在毒性成分，采用超高效液相串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定半夏中8种潜在的毒性成分，并测定其在半夏不同炮制品中的含量，利用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）［12］对炮制前后半夏中毒性成分含量进行分析，探讨这些潜在毒性成分含量变化与半夏不同炮制方法之间的相关性，为半夏炮制品的毒性评价和质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

1290-QQQ6460型超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）；UP-400S超声波细胞破碎仪（上海熙扬仪器有限公司）；ME104电子天平（梅特勒公司）；SUS 304中药粉碎机（圣顺公司）。

1.2 药材与试剂

生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏均购自四川成都康巴高原山珍中药材基地，经国药集团黑龙江省药材公司中药师张军鉴定均为正品。溶血磷脂酰胆碱（纯度≥98％）、苦参碱（纯度≥98％，内标物）均购自成都德思特生物有限公司；盐酸麻黄碱（纯度≥99％）、野黄芩苷（纯度≥98％，内标物）均购自中国食品药品检定研究院；葫芦巴碱（纯度≥98％）、胆碱（纯度≥90％）、原儿茶酸（纯度≥98％）、原儿茶醛（纯度≥98％）、尿黑酸（纯度≥98％）、大黄酚（纯度≥98％）均购自上海源叶生物有限公司；甲醇购自J&K Scientific；水为娃哈哈纯净水。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品溶液制备。

分别精密称取溶血磷脂酰胆碱、盐酸麻黄碱、葫芦巴碱、胆碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸、大黄酚的标准品各10 mg，加一定量甲醇至10 mL，得浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液。取各标准品溶液等量，加甲醇得浓度为2.0 μg/mL的混合标准品溶液，再进一步稀释到不同浓度。精密称量野黄芩苷、苦参碱标准品各5 mg，分别制得浓度为1.0 mg/mL，作为内标溶液（IS）。取上述配制的不同浓度混合标准品溶液500 μL，加入甲醇490 μL、内标溶液10 μL，混均，留存备用。

1.3.2 样品溶液制备。

将生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏粉碎，过筛（60目），备用。取半夏不同炮制品粉末各5.0 g，精密加入甲醇50 mL，并向其中加入内标溶液10 μL，超声波细胞破碎仪（功率360 W）提取30 min。连续提取2次，过滤，合并滤液。10 000 r/min离心10 min，取上清液进行UPLC-MS/MS测定。

1.3.3 超高效液相色谱-质谱联用条件。

HPLC色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSST3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为甲醇-水溶液，进样量4 μL，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃。梯度洗脱程序为0～6 min，25%～100%甲醇；6～10 min，100%甲醇。电喷雾离子源（ESI）作为质谱离子源，载气为氮气。扫描方式为正负离子同时检测，以多反应检测（MRM）模式扫描。其他质谱条件：干燥气流量为11.0 L/min，毛细管电压为3 000 V，离子源温度为350 ℃，雾化气压力为137.9 kPa。8种潜在毒性成分以及内标物的MRM质谱参数见表1。