鸡传染性支气管炎•H9亚型禽流感病毒与鸡毒支原体混合感染的诊治

摘要 通过病理学解剖、细菌分离与培养、病毒分离鉴定、动物回归试验和分子生物学检测，对山东省日照市某发病鸡场5只病死鸡进行诊断。病理学剖检显示，病鸡支气管栓塞，气管喉头出血，肺出血水肿、颜色发黑，输尿管有尿酸盐沉积，气囊增厚、有干酪物渗出；从发病鸡组织中未分离出细菌；分子生物学检测结果发现，鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和H9亚型禽流感病毒检测结果均呈阳性。经初步推断，发病鸡群存在鸡毒支原体隐性感染，又继发感染鸡传染性支气管炎和H9亚型禽流感病毒，多种病原混合感染造成鸡只死亡。建议该鸡场加强鸡传染性支气管炎和H9亚型禽流感防控措施，投喂抗病毒类药物。

关键词 鸡传染性支气管炎；H9亚型禽流感；鸡毒支原体

中图分类号 S858.31 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）04-0073-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.04.017

Diagnosis and Treatment of Mixed Infection of Avian Infectious Bronchitis Virus， Avian Influenza H9 Subtype Virus，Mycoplasma gallisepticum

JIANG Xiao-yang， WANG Yan， LIU Jun-yong et al

（Qingdao Hui Feng Animal Health Products Co.， Ltd.， Qingdao， Shandong 266109）

Abstract Through the methods of pathological anatomy，bacterial isolation and culture，virus isolation and identification，animal regression test and molecular biological detection， the etiology of 5 dead chickens in a chicken farm in Rizhao City， Shandong Province was diagnosed. Pathological autopsy showed bronchial embolism， tracheo laryngeal hemorrhage， pulmonary hemorrhage， edema， dark color， urate deposition in ureter， thickening of air bag and exudation of cheese;no bacteria were isolated from the diseased chicken tissues;molecular biological tests showed that the avian infectious bronchitis virus， Mycoplasma gallisepticum and avian influenza H9 subtype were positive. It was preliminarily inferred that the cause of the chicken herd was the secondary infection of chicken infectious bronchitis and avian influenza H9 subtype on the basis of the invisible infection of Mycoplasma gallisepticum， and the casualties caused by the mixed infection of multiple pathogens. It is suggested that the chicken farm strengthen the immune prevention and control measures of chicken infectious bronchitis and avian influenza H9 subtype， and use antiviral drugs.

Key words Chicken infectious bronchitis;Avian influenza H9 subtype;Mycoplasma gallisepticum

鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病，其临床症状为呼吸困难、发出啰音、张口呼吸、咳嗽，夜间关灯后症状尤为明显［1-2］。如果病原不是肾病变型毒株或不发生并发病，死亡率较低；若是肾病变型毒株，可能在肝脏等器官看到白色尿酸盐沉积，死亡率在20%左右［3］。

禽流感是禽流感病毒引起的一种对养鸡业危害较大的一种疾病，根据不同致病性分为高致病性毒株、低致病性中弱毒株和非致病性无毒株［4］。高致病性毒株导致的病死率可达100%；有些低致病性毒株导致的鸡死亡率为0～15%，另外饲养管理不当、鸡群营养状况不良以及环境应激因素都可能加重病情，当发生并发感染时可使鸡群死亡率升高［5］。

鸡毒支原体感染是鸡的一种慢性呼吸道病，流行于全世界鸡场中，在国内也普遍发生。根据血清学调查可知，鸡毒支原体平均感染率为70%～80%［6］。感染鸡通常表现为气管啰音、咳嗽、流鼻涕、流眼泪，一侧或两侧眼睑肿胀或黏合［7］。一般来说，鸡死亡率较低，发生环境应激或者并发感染时鸡死亡率升高，鸡毒支原体常与呼吸道有关的疾病伴发［8］。

春秋季节肉鸡多发呼吸道疾病，引起心衰、肺出血、水肿、发黑，甚至死亡，俗称“心肺病”或“黑肺病”，引起这种疾病的病因尚不清楚。有人认为，这是因为鸡场暴发过支原体感染，当时根除不彻底，后期又感染了其他呼吸道疾病或细菌感染；也有报道认为，引起该病的主要病原为低致病性禽流感病毒，又混合感染了其他细菌或病毒。大多数人认为，该病为混合感染，增加了该病的诊断难度［9］。笔者通过病理学解剖、细菌分离培养、病毒分离鉴定、动物回归试验和分子生物学检测对山东省日照市某发病鸡场5只病死鸡进行病因诊断，旨在为该病的防治与诊断提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验对象

山东省日照市某肉鸡场病死鸡5只、同一种鸡场1日龄雏鸡20只、10日龄SPF鸡胚15枚。

1.2 试验仪器

电热恒温培养箱（型号300，购自龙口市先科仪器公司）；PCR扩增仪（型号A300，购自杭州朗基科学仪器有限公司）；电泳仪（型号DYY-6C型，购自北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（Bio-Rad GelDoc XR，购自南京贝登医疗股份有限公司）；孵化器（购自山东德州旭升孵化设备研制中心）。

1.3 试验试剂

营养琼脂、麦康凯培养基、SS琼脂，均购自青岛海博生物技术有限公司；病毒组基因DNA/RNA提取试剂盒、 2× Accurate Taq预混液，均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 临床诊断和剖检。

询问并记录鸡群状态，检查病死鸡体表并进行剖检，无菌采集相关病变组织（留下部分肝脏），将病变组织与生理盐水按1∶2的质量比匀浆，反复冻融3次后离心取上清，备用（编号01）。

1.4.2 细菌分离与培养。

将无菌采集的肝脏按照细菌分离培养的方法接种到营养琼脂、麦康凯培养基、SS培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

1.4.3 病毒分离鉴定。

实验组取01号取组织液，经0.22 μm滤器过滤后，接种于10枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔中。连续观察72 h，每次间隔8 h，记录死亡数。收取尿囊液以及胚体，供血凝试验以及分子生物学检测（编号02）。

对照组取无菌生理盐水，经0.22 μm滤器过滤后，接种于5枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔中。连续观察72 h，每次间隔8 h，记录死亡数；收取尿囊液以及胚体，供血凝试验以及分子生物学检测（编号03）。

1.4.4 动物回归试验。

将20只雏鸡分成3组：一组12只，进行攻毒试验（试验组），另一组5只注射生理盐水（对照组），剩余3只（空白组）按相关病变组织无菌采集相应的组织，将组织与生理盐水按1∶2的质量比匀浆后，反复冻融3次、离心，取上清备用（编号04）。

取编号01组织液，对试验组7日龄肉鸡进行攻毒，攻毒方式为腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。

取无菌生理盐水，对对照组7日龄肉鸡进行攻毒，攻毒方式为腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。

攻毒后观察试验组和对照组鸡群的发育状态，连续观察14 d，每天观察3～4次，于15日龄分别采集口、鼻以及泄殖腔棉拭子，试验组编号05，对照组编号06。

在观察过程中记录鸡群状态，及时处理死亡鸡只，无菌采集病料，将病料

与生理盐水按1∶2的质量比匀浆，反复冻融3次，离心后取上清，备用。第15天，对所有鸡只进行处理，无菌采集相关病料，试验组死亡鸡只编号07、存活鸡只编号08，对照组死亡鸡只编号09、存活鸡只编号10。

1.4.5 分子生物学检测。

对上述所有编号的组织液以及尿囊液，根据核酸提取试剂盒说明书步骤提取核酸，并对提取的RNA进行反转录，得到cDNA；用家禽常患呼吸道疾病病毒的引物进行扩增后，取6～7 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，最后通过凝胶成像系统观察是否存在目的条带。

反转录体系：dNTP Mixture 2.0 μL、5×Buffer 4.0 μL、M-MLV 0.5 μL、Random Primer（nonadeoxyribonucleotide mixture;pd（N）9）1.0 μL、Recombinant RNase Inhibitor 0.5 μL、RNA 12.0 μL，总体积为20.0 μL。 反转录程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，4 ℃下保存。

PCR扩增体系：ddH2O 8.5 μL、2× Accurate Taq Mix 12.5 μL、上游引物 1.0 μL、下游引物 1.0 μL、DNA/cDNA 2.0 μL，总体积25.0 μL。 PCR扩增程序：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 42 s，48～60 ℃ 42 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；延伸72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。

2 结果与分析

2.1 临床诊断和剖检

山东省日照市某鸡场突然发病，以呼吸道症状为主，经询问养殖场老板了解到该养殖场曾暴发过鸡毒支原体感染，经过一段时间净化后鸡群比较稳定，该批鸡苗进场前鸡场已彻底清洗消毒，鸡苗进场前免疫新城疫禽流感二联苗，7日龄免疫鸡传染性支气管炎4/91 QX型二联减毒疫苗，前期鸡群发育正常，15日龄个别鸡出现气喘，18日龄鸡群出现咳嗽，关灯后尤为明显，并出现鸡只死亡，严重时死亡率高达18%。对死亡鸡只进行病理学剖检，发现支气管栓塞、气管喉头出血、肺出血水肿发黑、气囊增厚且有干酪物、肝脏肿大、肾脏肿大、输尿管有尿酸盐沉淀、法氏囊肿大［10］（图1）。

2.2 细菌分离培养

在营养琼脂、麦康凯培养基、SS培养基上，37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，经观察未发现有细菌菌落生长（图2）。

2.3 病毒分离鉴定

试验组：接种鸡胚后，前48 h鸡胚发育正常，48 h后鸡胚血管轻微脱落，64 h鸡胚全部死亡。收取尿囊液，经血凝试验发现有血凝现象发生，血凝效价为26。

对照组：接种鸡胚后，鸡胚发育正常，无死亡；64 h终止孵化，收取尿囊液后经血凝试验未发现有血凝现象发生。

2.4 动物回归试验

攻毒前对试验雏鸡进行病理学剖检，未发现明显的病理变化。