基于转录组测序方斑东风螺LPS刺激的免疫机制研究

摘要 ［目的］进一步挖掘方斑东风螺（Babylonia areolata）免疫系统中参与响应脂多糖刺激的重要功能基因与通路。［方法］采用Illumina HiSeqTM 2000高通量测序平台对不同处理条件的方斑东风螺进行测序分析。所得的原始数据经质控、组装后分别比对到KOG、Nr、Swiss-Prot和KEGG数据库进行功能注释，筛选差异表达基因并进行聚类分析。［结果］GO功能注释结果显示，多数unigenes被注释到代谢过程（metabolic process）、催化活性（catalytic activity）和细胞过程（cellular process）。KEGG注释结果显示，多数差异表达基因集中于代谢通路（Metabolic pathways）（28.3%）、次生代谢物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）（8.69%）、核糖体（Ribosome）（7.47%）和内吞作用（Endocytosis）（5.84%）。对比对照组，试验组中LPS刺激后4 h组具有9 096个差异表达基因，8 h组具有10 335个差异表达基因，而4 h组和8 h组间则存在8 756个差异表达基因，通过 KEGG 数据库对 DEGs 进行注释和功能富集，关注到的显著通路包括NOD样受体信号通路、趋化因子信号通路等。［结论］暗示脂多糖调节方斑东风螺的抗病能力通过许多通路，是一个复杂的过程，可为进一步研究方斑东风螺的免疫响应机制研究提供理论数据。

关键词 方斑东方螺；转录组；脂多糖；免疫通路

中图分类号 S917.4 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）04-0085-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.04.021

Exploration Related to Immune Mechanism of Babylonia areolata in Response to LPS Challenged Based on Transcriptome Sequencing

CHEN Zong-fa，HONG Yu-jie，ZHAO Ming-ming et al

（Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract ［Objective］To further explore the important functional genes and pathways involved in the immune mechanism stimulated by LPS.［Method］The transcriptomes of foot of Babylonia areolata were sequenced through high-throughput sequencing technology.After trimming and filtering，the original data were compared to KOG，Nr，Swiss-Prot and KEGG databases for functional annotation and differential gene cluster analysis.［Result］The results of GO functional annotation showed that most of the unigenes were annotated to metabolic process，catalytic activity and cellular process.KEGG pathway annotations showed that most differentially expressed genes were mainly concentrated in Metabolic pathway （28.3%），biosynthesis of secondary metabolites （8.69%），ribosome （7.47%） and endocytosis （5.84%）.Compared with the control group，there were 9 096 differentially expressed genes in the experimental group at 4 h after LPS stimulation，10 335 differentially expressed genes at 8 h after LPS stimulation，and 8 756 differentially expressed genes at 4 h and 8 h after LPS stimulation.DEGs was annotated and functionally enriched by KEGG database，including nod-like receptor signal pathway，chemokine signal pathway and so on.［Conclusion］The results of this study enrich the genetic resources of Babylonia areolata，and provide basic theoretical data for further study of the immune response mechanism of Babylonia areolata.

Key words Babylonia areolata;Transcriptome;LPS;Immune pathway

方斑东风螺（Babylonia areolata）俗称花螺，属软体动物门腹足纲前鳃亚纲新腹足目蛾螺科东风螺属［1］，主要分布于环西太平洋。其生产周期短，具有肉质劲道、味道鲜美、营养价值丰富等优点［2］。但是随着方斑东风螺养殖的快速发展，育苗与养殖过程中病害暴发日趋严重［3］，其病害主要以革兰阴性菌感染为主［4-6］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞壁外膜结构的重要组分，可作用于不同生物细胞而表现出多种生物活性［7］。朱璐璐［8］研究发现，饲料中添加LPS能提高凡纳滨对虾对WSSV和副溶血弧菌的抵抗力，周妍英等［9］研究发现，脂多糖可以诱导河南华溪蟹提高血淋巴细胞酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶活性和酚氧化酶活性，从而增强其免疫能力，被广泛应用于水生动物的免疫学研究，揭示LPS刺激对方斑东风螺转录组的影响，有助于培育抗病品种。

转录组测序（RNA-seq）是一种利用深度测序技术进行转录组分析的方法［10］。转录组是随着生物生长发育阶段、生理状态和外界环境的改变而变化的［11］，因此转录组测序在水生生物的生长［12］、免疫［13］、适应［14］等方面的研究中得到了广泛应用。吴勇等［15］通过RNA-seq测序研究马氏珠母贝（Pinctada fucata）血细胞中存在的补体系统组分，结果表明其补体系统可能通过凝集素途径或替代途径发挥生物学功能；张中日［16］通过转录组测序分析得出，氰氟草酯使斑马鱼（Brachydanio rerio var）的差异表达基因在药物等代谢途径、代谢-细胞色素P450、抗生素的生物合成和外来物质的代谢等途径明显富集；张恒泽等［17］通过转录组测序，揭示了大黄鱼（Larimichthys crocea）对致病性假单胞菌（LAV）的免疫应答机制，LAV免疫有效激发鱼体的细胞免疫应答，有助于快速清除胞内病原。

笔者以方斑东风螺为试验对象，经LPS注射后，利用 RNA-seq 技术获得转录本后，通过DEGs的表达分析和功能富集分析，揭示LPS调控方斑东风螺DEGs的功能和通路。该研究有助于全面深入了解细菌对方斑东风螺发生发展的分子机制，为方斑东风螺的遗传改良提供理论基础，对其养殖产业健康持续发展有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

方斑东风螺购自广东省湛江市某东风螺养殖场，平均体质量为25 g，于实验室海水桶中暂养7 d（80 L，25 ℃）。将方斑东风螺随机分为试验组和对照组，试验组对方斑东风螺注射100 μL 0.5 mg/mL LPS悬浮液，对照组注射同体积的pH 7.0的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS），分别于刺激后4、8 h（分别记为LPS-4 h、LPS-8 h组）采集各组足组织样品，于液氮中速冻，置-80 ℃下保存，用于转录组分析。

1.2 转录组测序

转录组文库的制备及测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。使用TRIzol法提取总RNA，利用NanoDrop 2000检测所提RNA的纯度，利用Agilent 2100检测所提RNA的浓度，同处理组10个个体样本合并后进行建库测序，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第1条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2条cDNA链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱后进行末端修复、加poly（A）并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序，测序读长为双端150 bp。

1.3 转录组数据分析

测序仪产生的原始图像数据转化为序列数据（raw reads），经过初步的过滤后得到质控数据（clean date或clean reads），再对下机的clean reads去除含有带接头、重复、测序质量很低的reads，最后得到高质量的质控数据（clean reads）。通过Trinity［18］软件进行转录组从头组装。通过BLAST［19］将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、SwissProt、KEGG和COG/KOG（evalue<1×10-5），得到与给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。

1.4 差异表达基因（DEGs）分析

采用短reads比对软件Bowtie2［20］将高质量质控数据与参考基因序列进行对比，根据对比结果，使用RPKM法（Reads Per kb per Million reads）计算Unigene的表达量。利用edgeR［21］进行RNA-seq数据成对样本之间或组间的差异表达分析，获得不同时间梯度的DEGs。在筛选过程中，利用FDR与log2FC筛选DEGs，筛选条件为FDR<0.05且|log2FC|>1。得到DEGs后，对DEGs进行GO功能注释分析及KEGG Pathway富集分析。

2 结果与分析

2.1 测序结果统计及质量评估

用Illumina HiSeqTM2000分别对方斑东风螺LPS空白对照组（BLANK）、LPS刺激4 h后取样组（LPS-4 h）和LPS刺激8 h后取样组（LPS-8 h）测序，共构建了3个转录组文库，共获得81 773条unigenes，序列平均长度681 bp，序列长度中位数（N50）为1 035 bp，每组GC含量为46.15%～47.81%，过滤后的clean reads在97.58%～97.74%， Q20均不小于98.49%， Q30均不小于95.40%（表1），说明测序质量良好，能进行后续的数据分析［22］。从长度分布（图1）与GC含量等方面对unigenes进行评估，数据显示测序质量好，可信度高。