5种金边瑞香基因组DNA提取方法比较研究

摘要  ［目的］研究不同提取方法对金边瑞香基因组DNA提取质量的影响，筛选最佳提取方法。［方法］以金边瑞香叶片为试材，以SDS法、改良CTAB法、SDS-CTAB法、高盐低pH法和尿素法5种方法提取基因组DNA，并从DNA纯度、浓度、酶切电泳结果和ISSR-PCR扩增产物电泳等方面进行比较分析。［结果］高盐低pH法和尿素法提取的金边瑞香基因组DNA富含蛋白质和多糖等杂质，DNA纯度低；SDS法提取的基因组DNA含有一些酚类物质和盐等杂质，DNA纯度较低；改良CTAB法提取的基因组DNA纯度较高，但浓度和产率低。SDS-CTAB法提取的基因组DNA纯度、浓度和产率最高，酶切和ISSR-PCR产物电泳检测效果最好。［结论］SDS-CTAB法提取的金边瑞香基因组DNA质量与产量最佳，可以满足后续分子生物学研究的需求。

关键词  金边瑞香；基因组DNA；提取方法

中图分类号  S 685.99   文献标识码  A   文章编号  0517-6611（2023）05-0074-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.019

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Comparative Study on Five Genomic DNA Extraction Methods of Daphne odora

LUO Su-mei1，2，GUO Chong-yan1，LIU Xiao-ping1，2 et al

（1.Vegetable and Flower Research Institute of Ganzhou，Ganzhou，Jiangxi 341404;2.Ganzhou Key Laboratory for Development and Utilization of Vegetable and Flower Germplasm Resources，Ganzhou，Jiangxi 341404）

Abstract  ［Objective］In order to study the effect of different methods on the quality of genomic DNA extraction from Daphne odore，the most suitable extraction method was selected.［Method］Using leaves of Daphne odore as materials，the genomic DNA was extracted by SDS method，modified CTAB method，SDS-CTAB method，high salt low pH method and urea method，which compared and analyzed on the DNA purity，concentration，enzyme digestion electrophoresis results and ISSR-PCR amplification product electrophoresis.［Result］The results showed that the genomic DNA extracted by high salt，low pH method and urea method was rich in impurities such as protein and polysaccharide，that the purity of DNA was low.The genomic DNA extracted by SDS method contains some impurities such as phenols and salts，which the purity of DNA was low.The genomic DNA extracted by modified CTAB method has high purity，but low concentration and yield.The purity，concentration and yield of genomic DNA extracted by SDS-CTAB method were the highest，further more，the effect of enzyme digestion and ISSR-PCR product electrophoresis detection also was the best.［Conclusion］The genomic DNA extracted by SDS-CTAB method has the best quality and yield of Daphne odore，which can meet the needs of subsequent molecular biology research.

Key words  Daphne odore;Genomic DNA;Extraction methods

金边瑞香（Daphne odore var.marginnata）是瑞香科瑞香属瑞香的一个变种，为多年生常绿灌木花卉，是我国传统名花之一，其叶片边缘金黄，花色淡紫，花香浓烈独特，深受广大人民喜爱［1-2］。金边瑞香富含黄酮类、香豆素类和黏多糖等生理活性物质，具有抑菌、镇痛、抗氧化和调节免疫等功效，是一味珍贵的中药材［3-4］。金边瑞香是我国特有的种质资源，为江西省赣州市的地方特色花卉，在赣南大部分区县均有栽培，畅销国内外市场且已形成产业化规模［1，5-6］。

目前，国内外对金边瑞香的研究主要集中于栽培管理、组培繁育、生物化学性质和医药应用等方面［7-10］，而关于其分子生物学方面的研究较少［11］。随着现代生物技术的高速发展，植物分子遗传分析等技术也必将运用到金边瑞香的种质资源保护、功能基因挖掘和品种改良等方面，而获得高质量的基因组DNA 是开展金边瑞香分子生物学研究的基本前提。对于一种植物采用不同的基因组DNA提取方法，其纯度和产量可能会产生很大差异［12］，而所提取的植物基因组DNA质量是影响后续PCR、酶切等分子试验的重要限制因素之一［13］，因此针对不同种类植物建立相应的DNA分离纯化方法以获取高质量的基因组DNA显得至关重要。笔者采用SDS法、改良CTAB法、SDS-CTAB法、高盐低pH法和尿素法5种方法对金边瑞香基因组DNA提取效果进行比较研究，以摸索出适宜该植物的DNA提取纯化方法，为金边瑞香后续相关分子生物学研究提供有益参考和指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料    金边瑞香植株取样于江西省赣州市大余县，种植于赣州市蔬菜花卉研究所试验大棚。

1.2 试验仪器与试剂    移液器（赛默飞世尔）、恒温水浴锅（力辰科技）、离心机（赛默飞世尔）、超微量紫外分光光度计（上海嘉鹏）、凝胶成像仪（德国耶拿）、PCR仪（赛默飞世尔）、水平电泳仪（伯乐）。

试验所用试剂中限制性内切酶、DNA Marker和Taq酶均为北京全式金生物技术股份有限公司产品，其余均为国产分析纯试剂。

1.3 DNA提取方法

1.3.1    改良CTAB法。参考余志雄等［14］的方法，并加以改进。取金边瑞香叶片0.1 g，加入0.05 g PVP-40，用液氮研磨成细粉后转入2 mL无菌EP管中。立即加入1 mL 65 ℃预热的提取缓冲液（100  mmol/L Tris-HCl、20  mmol/L EDTA ·Na2、1.4 mol/L NaCl、2% CTAB、5  mmol/L二乙基二硫代氨基甲酸）并加入40 μL β-巯基乙醇，漩涡混匀30 s，65 ℃水浴30 min。加入400 μL 5 mol/L 乙酸钾溶液（pH 4.8），混匀，冰水浴10 min。12 000 r/min离心10 min，吸取上清液。向上清液中加入等体积氯仿 ∶异戊醇（体积比24 ∶1），漩涡混匀。12 000 r/min离心10 min，吸取上清液。向上清液中加入等体积-20 ℃预冷异丙醇，轻柔颠倒混匀5次后-20 ℃静置10 min。12 000 r/min离心10 min，弃上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重复洗涤、沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，置于-20 ℃保存备用。

1.3.2    SDS法。参考杨春霞等［15］的方法，并加以改进。取0.1 g 金边瑞香叶片加入液氮研磨成粉末后装入2 mL离心管中，加入1 mL提取缓冲液（2% SDS、100  mmol/L Tris-HCl、50  mmol/L EDTA·Na2、1.5 mol/L NaCl、6% PVP-40）和40 μL β-巯基乙醇，混匀，65 ℃水浴30 min。 再加入400 μL 4 mol/L乙酸钾溶液（pH 4.8），混匀，冰水浴10 min。12 000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入等体积氯仿 ∶异戊醇（体积比24 ∶1），混匀。12 000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入等体积-20 ℃预冷异丙醇，轻柔混匀，-20 ℃静置10 min。12 000 r/min离心10 min，弃上清液，保留DNA沉淀。加入700 μL 75%乙醇，混匀漂洗DNA沉淀。12 000 r/min离心5 min，弃上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重复洗涤、沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，-20 ℃保存备用。

1.3.3    SDS-CTAB法。参考孙鑫等［16］的方法， 并加以改进。取金边瑞香叶片0.1 g加入液氮研磨成粉末后立即加入0.05 g  PVP-40粉末，装入2 mL离心管中，立即加入1 mL提取缓冲液（100  mmol/L Tris-HCl、50  mmol/L EDTA·Na2、1mol/L NaCl、2% SDS，pH 8.0）和60 μL β-巯基乙醇，混匀，65 ℃水浴30  min。加入1/3体积5 mol/L 乙酸钾溶液（pH 4.8），混匀，冰水浴10 min。12 000 r/min离心10 min，取上清液，加入1/4体积CTAB buffer（100  mmol/L Tris-HCl、50  mmol/L EDTA·Na2、1 mol/L NaCl、10% CTAB，pH 8.0），混匀，65 ℃水浴15 min。加入等体积氯仿 ∶异戊醇（体积比24 ∶1），混匀。12 000 r/min离心10 min，取上清液。加入等体积-20 ℃预冷异丙醇，混匀，-20 ℃静置10 min。12 000 r/min离心10 min，弃上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重复洗涤，沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，放-20 ℃保存备用。

1.3.4    高盐低pH法。参考邵亚林等［17］的方法，并加以改进。取0.1 g金边瑞香叶片，用液氮研磨成细粉后加入2 mL离心管中。立即加入1 mL 65 ℃预热的提取缓冲液 （100 mmol/L乙酸钠溶液、50 mmol/L EDTA·Na2、500 mmol/L  NaCl、2% PVP-40，pH 5.5）和40 μL β-巯基乙醇，漩涡混匀30 s，65 ℃水浴30 min。12 000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入400 μL 2.5 mol/L 乙酸钾溶液（pH 4.8），混匀，冰水浴10 min。12 000 r/min离心10  min，取上清液。向上清液中加入等体积氯仿 ∶异戊醇（体积比24 ∶1），混匀。12 000 r/min离心10  min，取上清液。向上清液中加入等体积的-20 ℃预冷异丙醇，轻柔颠倒混匀5次后-20 ℃静置10  min。12 000 r/min离心10  min，弃上清液，保留DNA沉淀。加入700 μL 75%乙醇，混匀漂洗DNA沉淀。12 000 r/min离心5  min，弃上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重复洗涤、沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，-20 ℃保存备用。