乙醇-硫酸铵双水相体系萃取虾壳中虾青素研究

摘要  采用乙醇-硫酸铵双水相制备虾壳中的虾青素，探索虾壳中虾青素提取的条件。结果表明：采用乙醇溶液，料液比1 ∶15，每次提取3 h，提取2次，提取效果较好。采用乙醇-硫酸铵双水相萃取虾青素，虾青素主要集中在上下两相之间，最佳条件：20%硫酸铵∶虾青素乙醇提取液（v/v）=2.5 ∶2.0，沉淀率为89.09%。经薄层色谱法和高效液相色谱法检测，双水相萃取可使虾青素提取液中的各类型虾青素都沉淀。

关键词  虾青素；双水相体系；分离

中图分类号  TS 254.9   文献标识码  A   文章编号  0517-6611（2023）05-0176-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Extraction of Astaxanthin from Shrimp Shells by Ethanol /（NH4）2SO4 Aqueous Two-phase System

FENG Jin-hua， HE Zi-yuan， LIU Hong-ying et al

（Hebei Agriculture University， Qinhuangdao， Hebei 066003）

Abstract  Astaxanthin in shrimp shell was prepared by ethanol/（NH4）2SO4 aqueous two-phase method. The extraction conditions of astaxanthin from shrimp shell were explored. It was determined that ethanol solution was used， the solid-liquid ratio was 1 ∶15， extracted for 3h and twice， and the extraction effect was better. Astaxanthin was extracted by ethanol/（NH4）2SO4 aqueous two-phase extraction. Astaxanthin was mainly concentrated between the upper and lower phases. The optimum condition was that 20% （NH4）2SO4 ∶ astaxanthin ethanol extract（v/v） = 2.5 ∶2.0， and the precipitation rate was 89.09%. By TLC and HPLC examination， all kinds of astaxanthin in astaxanthin extract can be precipitated by aqueous two-phase extraction. This environmentally friendly method has potential application prospects in the large-scale separation of astaxanthin.

Key words  Astaxanthin;Aqueous two-phase system;Separation

虾青素又称变胞藻黄素，英文习惯命名为Astaxanthin，全反式虾青素的中文系统命名为全反式3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′胡萝卜素，相对分子质量为596.86，纯虾青素是暗红紫色粉末，熔点224 ℃，不溶于水，能溶解于大多数有机溶剂［1］。虾青素天然产物多数以酯的形式存在，有些是一元酯，有些是二元酯，存在于自然界中的大部分虾青素及其酯为全反式异构体［2］。

虾青素具有独特的着色功能，进入动物体内后可以不经修饰或生化转化而直接贮存、沉积在组织中［3］。虾青素在保护细胞膜磷酸酯和其他脂类的超氧化方面表现突出。虾青素在淬灭活性氧的活性及清除自由基方面能力比β-胡萝卜素高10倍以上，比VE强百倍以上。同时，虾青素具有抑制脂质过氧化作用，具有显著降低脂质过氧化物累积的作用［4］。虾青素还具有一定的抗癌特性。Tanaka等［5］在用硝基喹啉-1-氧化物诱发大鼠口腔癌的类似试验中，观察到虾青素能显著降低口腔肿瘤的发生率。这些决定了虾青素的应用价值及商业价值。

双水相萃取技术是一种操作简单、易于放大的分离方法，自20世纪60年代提出以来受到广泛关注。该技术的原理是生物物质在双水相体系中的选择性分配。当生物物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，表现出一定的分配系数。不同的物质在特定的体系中有着不同的分配系数［6］。近30年来，双水相萃取已涉及酶、核酸、 生长激素、病毒、色素、生物碱等有效成分的分离及提纯。但是有关该技术应用于虾青素的提取和分离尚鲜见相关研究报道。

目前，已有的萃取体系有高聚物-高聚物-去离子水、高聚物-盐-去离子水、离子液体-盐-去离子水、小分子有机溶剂-盐-去离子水等。考虑到虾青素易溶于有机溶剂不溶于水的性质，笔者选择小分子有机溶剂-盐-水体系，采用乙醇-硫酸铵双水相体系对虾青素进行分离研究，旨在为虾青素双水相制备的可行性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1    原材料。冷冻南美白对虾，购于河北省秦皇岛市海港区市场。

1.1.2    主要仪器。721型可见光分光光度计，上海舜宇恒平科技有限公司；Sigma 3-30k实验室高速冷冻离心机，塞维斯科技（北京）有限公司；FA2104N型精密分析电子天平，上海菁海仪器有限公司；FM100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；HH-8型恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；H185OR型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；D2F-6050AB型电热真空干燥箱，天津工兴实验室仪器有限公司；LC-20A型岛津高效液相色谱仪，Shimadzu岛津公司。

1.1.3    主要试剂。虾青素标准品（S13036-250 mg >98.0%），上海源叶生物科技有限公司；硅胶板（规格50 mm×100 mm；厚度0.20～0.25 mm），青岛海洋化工有限公司；甲醇（色谱纯）、四氢呋喃（色谱纯），天津康科德科技有限公司；无水乙醇（AR）、硫酸铵（AR），天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1    虾壳中虾青素的提取。将新鲜的虾壳用5%稀盐酸浸没，搅拌，静置1 h，至不再有气泡产生，然后用清水洗至中性，60 ℃下烘干，-10 ℃冰箱保存备用。

为检测提取时间对虾青素提取效果的影响，取干燥的虾壳，粉碎，设置料液比为1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20，在室温下，用乙醇分别浸提虾壳，检测提取1、2、3、4、5、9 h，用每组提取液在476 nm处的吸光度来判断提取液中虾青素的含量。每组设置3个平行。

为检测提取次数对虾青素提取的影响，分别检测了料液比分别为1 ∶5、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20，在分别提取1、2、3次（每次提取3 h）时，虾青素提取液在476 nm的吸光度，并计算虾青素的提取量。每组3个平行。

样品液中虾青素含量的计算根据Beer-Lamben定律［7］，计算公式：

m= A×V×106 A1%1 cm×100

式中，m为类胡萝卜素含量，μg；

A为溶液吸光度；

V为溶液体积，mL。

其中，吸光系数A1%1 cm为在1 cm光程长的比色杯中1 g/L浓度溶质的理论吸收值。虾青素标准样品在乙醇中的吸光系数为2 365 L/（g·cm）。

1.2.2    乙醇-硫酸铵双水相体系的配制。配制质量体积分数分别为10%、20%、30%（w/v）的硫酸铵溶液，取2.0 mL无水乙醇溶液，分别与不同体积的硫酸铵溶液混合，在25 ℃下静置30 min，观察并记录成相情况。

1.2.3    乙醇-硫酸铵双水相溶液萃取虾壳中的虾青素。利用“ 1.2.1 ”中的制备方法提取虾壳中虾青素，并适当浓缩。然后向一定体积的虾青素乙醇提取液中（A476 nm=1.694，7.163 μg/mL）加入一定体积的20%、30%的（NH4）2SO4溶液，配制成双水相，检测双水相上相中虾青素在476 nm处的吸光度。

1.2.4    虾青素的薄层色谱测定。50 mm×100 mm的硅胶板，展开剂为25%丙酮和75%正己烷，完成薄层分离后测Rf值。

1.2.5    虾青素的高效液相色谱检测。色谱柱为C18：250.0 mm×4.6 mm，采用甲醇（B）和四氢呋喃（A）梯度洗脱的方式（表1），流速0.8 mL/min，检测波长476 nm，进样量10 μL，柱温20 ℃。

2 结果与分析

2.1 乙醇浸提时间对虾青素提取的影响

在室温下，通过对4组料液比进行虾壳中虾青素提取的研究发现（图1），4组在提取3 h之前，随着提取时间的延长，提取液中虾青素均逐渐增大；提取时间在3 h左右，虾青素在溶液中浓度达到较高值；3 h以后，随着浸提时间的延长，虾青素的浓度反而变得不稳定，除料液比1 ∶ 8组外，基本未出现持续增加的情况，主要趋势是在3～5 h虾青素浓度变化不大，5～9 h，除料液比1 ∶ 8组基本呈现下降趋势，但下降速度不快。这说明在室温下，提取虾青素的过程中，3 h左右易达到溶解平衡，提取时间继续延长，溶解的虾青素可能发生分解，反而开始下降。因此，在提取虾壳中虾青素时，可以设定提取时间为3 h左右。

2.2 乙醇浸提料液比及提取次数对虾青素提取的影响

称取0.5 g虾皮，选择料液比1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20进行提取，每次提取3 h。从图2可以看出，提取1次，所获得提取液虾青素的吸光度均在0.3以上，对虾壳提取第2次时，虾青素的吸光度明显降低；1 ∶ 5料液比组第2次提取后，吸光度仍较高，1 ∶ 8和1 ∶ 10组提取液的吸光度基本在0.2左右；1 ∶ 15和1 ∶ 20提取液的吸光度较低；提取第3次，1 ∶ 5组提取液中虾青素的吸光度仍较高。这说明采用1 ∶ 5料液比提取3次，虾青素有较多的剩余量。

由表2可知，5个料液比下，以1 ∶ 15料液比组提取虾青素量最多。因此在提取虾青素时，采用1 ∶ 15料液比较合适。

2.3 乙醇-硫酸铵双水相溶液的配制

先用10%、20%、30%（w/v） 的硫酸铵溶液和无水乙醇进行混合试验，以配制25 ℃乙醇-硫酸铵双水相体系，试验结果见表3～5。由表3可知，采用10%硫酸铵溶液进行双水相配制不易形成双水相。

由表4可知，采用20%硫酸铵溶液进行双水相配制，无水乙醇 ∶ 20%硫酸铵（v/v）=1 ∶ 1、1 ∶ 1.25、1 ∶ 1.50，可以形成双水相，且不会出现硫酸铵沉淀，且上相比下相体积大得多。