基于核基因和微卫星的叶城沙蜥遗传多样性分析

摘要 为了研究我国特有物种叶城沙蜥（Phrynocephalus axillaris）的遗传多样性，采用微卫星和核基因分子标记方法，对新疆7个地区所采集的96只叶城沙蜥进行了遗传多样性分析。基于对6个微卫星位点和核基因BDNF的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，利用软件进行分析，结果表明群体单倍型多样性为0.707和平均核酸多样性为0.003 14，观察到的杂合度平均值和预期杂合度平均值分别为0.52和0.65，总Fst值为0.175，发现试验研究所采集的叶城沙蜥群体存在明显的遗传差异及种群间存在较大的遗传分化。综合分析说明采集的叶城沙蜥群群体间遗传交流水平低，存在较高程度的遗传分化，但由于样本较少仍需对叶城沙蜥种群遗传特征进一步研究。补充和丰富了新疆部分地区叶城沙蜥的基础遗传数据，为后续合理利用及保护该地区内其他物种的种质资源奠定了基础。

关键词 叶城沙蜥；微卫星; 脑源性神经营养因子（BDNF）;遗传;种群

中图分类号 Q953 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）06-0081-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.021

Genetic Diversity Analysis of Phrynocephalus axillaris Based on Nuclear Gene and Microsatellite

XIE Hui1，JIANG Luo－xue1，ZHAO Wei2 et al

（1.Life Science and Engineering College，Northwest University for Nationalities，Lanzhou，Gansu 730100;2.College of Life Sciences，Lanzhou University，Gansu Provincial Key Laboratory of Environmental Biomonitoring and Restoration，Lanzhou，Gansu 730030）

Abstract In order to study the genetic diversity of the endemic species Phrynocephalus axillaris in China，the genetic diversity of 96 P.axillaris collected from seven regions of Xinjiang was analyzed by microsatellite and nuclear gene molecular markers.Based on the PCR amplification and agarose gel electrophoresis detection of six microsatellite loci and nuclear gene BDNF，the software was used for analysis.The results showed that the haplotype diversity of the population was 0.707 and the average nucleic acid diversity was 0.003 14.The average observed heterozygosity and expected heterozygosity were 0.52 and 0.65，respectively，and the total Fst value was 0.175.It was found that there were obvious genetic differences and large genetic differentiation among the populations collected in the experiment.Comprehensive analysis showed that the level of genetic communication among the collected populations was low，and there was a high degree of genetic differentiation.However，due to the lack of samples，it is still necessary to further study the genetic characteristics of the population.This study supplemented and enriched the basic genetic data of P.axillaris in some regions of Xinjiang，and laid the foundation for the subsequent rational utilization and protection of the germplasm resources of other species in the region.

Key words Phrynocephalus axillaris;SSR;BDNF;Heredity;Populations

叶城沙蜥（Phrynocephalus axillaris）是鬣蜥科（Agamidae）沙蜥属（Phrynocephalus）的爬行动物［1］，属于我国特有的一种小型爬行动物，已被列入《世界自然保护联盟》（IUCN）2010年濒危物种红色名录。广泛分布于我国甘肃、西藏、新疆天山山脉南部地区，包括塔里木盆地及周边的吐鲁番—哈密盆地和敦煌盆地［2］。栖息在戈壁荒漠或沙漠边缘地带以及固定沙丘的丘间平地，有少数植被覆盖，垂直分布的海拔高度为65～1 500 m，在阿尔金山南麓甚至可达3 000 m左右［3］。利用线粒体基因对于叶城沙蜥种群遗传结构的研究未得到很好的解析，有可能与其分化时间太短或不完全谱系分选有关［4-5］。而基于微卫星位点变异速率快、多态性高等特点，有望更全面地解析叶城沙蜥的种群遗传结构［6］。

微卫星标记，又称简短串联重复（short tandem repeats，STRs）或简单序列重复（simple sequence repeats，SSRs），是一种基于DNA长度多态性的分子标记技术。微卫星DNA由于具有特异性的PCR扩增、多态信息容量（PIC）高、引物通用性好、突变率高、共显性、符合孟德尔遗传、易于检测等优势，已被广泛应用于种群遗传、谱系地理和亲子鉴定等领域［7-11］。微卫星标记较线粒体基因更具丰富的多态性，也是野生动物遗传学分析常用的分子标记之一，研究者可以利用分子标记研究种群的扩散模式，从而更有效地保护和管理野生动物。仲光启等［12］筛选了在黑鹳上可扩增的18个微卫星位点并进行了遗传特点分析，王萌等［13］探讨了微卫星标记方法在大型猫科动物保护群遗传学研究中的应用与挑战，刘旭等［14］概述了微卫星技术在珍稀濒危野生动物中的相关应用以及分子生物学手段在珍稀濒危野生动物扩散生态学的研究情况。对于沙蜥属的研究主要与环境气候变化有关，有红尾沙蜥超氧化物歧化酶适应高原的分子机制［15］、青海沙蜥遗传和表型分化的环境相关性［16］、增温对青海沙蜥繁殖生活史及后代适合度的影响［17-18］等。目前关于叶城沙蜥中的研究相对较少，主要在两性异形和形态特征差异、线粒体和基于高通量测序微卫星特征分析［19］，而关于微卫星分析研究较少。该研究利用高质量的SSR标记评估96只叶城沙蜥的遗传多样性，解析不同群体遗传结构，为叶城沙蜥及新疆地区的物种保护提供理论依据。该研究利用6个微卫星位点和1对核基因引物，分析了7个地理种群96个样本的遗传多样性、遗传分化和系统地理结构，对叶城沙蜥进行系统发育分析，补充和丰富新疆地区叶城沙蜥的基础遗传数据，为保护该地区内其他物种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验研究对象为新疆7个地区（且末、民丰、策勒、和田、皮山、叶城、喀什）采集的96只叶城沙蜥，将组织样本均置于无水乙醇与生理盐水（1∶1配比）组织保存液中，-20 ℃保存备用（表1）。

1.2 基因组DNA的提取

使用通用型基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取，并用红色荧光核酸染料染色的1.4%琼脂糖凝胶电泳进行DNA的完整性和浓度检测，并于放置于-20 ℃冰柜保存备用。

1.3 引物筛选及PCR扩增

试验随机选取4只叶城沙蜥组织作为筛选阶段的材料，根据已发表的沙蜥文献中引物信息及重新设计的叶城引物进行筛选［6］，选出3对南疆沙蜥（Pvms33、Pvms39、Phr51）［20-21］和新设计的3对叶城沙蜥（PA11、PA36、PA37）微卫星引物（表2）。PCR反应体系为（12 μL）：5×buffer（Mg2+ free） 2.4 μL、5 U/μL Immolase DNA聚合酶0.06 μL、10 μmol/L荧光标记上游引物tag F（Fam、Ned、Vic、Pet）0.09 μL、10 μmol/L荧光标记下游引物tag R 0.09 μL、0.4 μmol/L Primers 2.4 μL、DNA模板2 μL、其余由dd H2O补足12 μL。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性10 min;92 ℃变性60 s，50 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，5个循环；92 ℃变性30 s，63 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，20个循环;92 ℃变性15 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，40个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪上观察结果。将成功扩增的合格PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行毛细管电泳分析。

根据GenBank公布的叶城沙蜥核基因（脑源性神经营养因子，brain-derived neurotrophic factor，BDNF）部分序列（序列号为KJ363410），使用Geneious Prime 2022.0.1（www.geneious.com）进行引物设计，上游引物：BDNF-11F（5′-TGCATGAAAGCTGCCCCAAT-3′），下游引物BDNF-600R（5′-CTGGGTAGTTCGGCACTGAT-3′）。引物由艾科瑞生物（湖南）公司合成。使用设计的引物对叶城沙蜥样本进行扩增。通过试验，建立最佳PCR扩增体系（25 μL）：2×Pro Taq Master Mix（dye plus）12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、模板DNA 2.0 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR反应条件：94  ℃预变性3 min；94  ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72  ℃延伸1 min，共循环 35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测。检测合格的扩增产物由兰州天启基因生物科技有限公司进行测序。

1.4 数据分析

试验中所得到微卫星数据用GeneMarker［22］对测序仪得到的原始数据进行基因分型分析。用GenAlex V 6.5［23］和Popgene32［24］软件分析等位基因数（number of allele，Na）、有效等位基因数（effective number of allele，Ne）、观测杂合度（observed heterozygosity，Ho）、期望杂合度（expected heterozygosity，He）、群体间Nei’s遗传距离和遗传相似度、群体内近交系数（population inbreeding coefficient，Fis）、群体间的遗传分化指数（genetic differentiation index，Fst）、基因流（gene flow，Nm）、Shannon多样性指数（I）及方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）。用Cervus3.0软件［25］计算各位点的多态信息含量（Poly-morphism information content，PIC），并进行哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验。用MEGA X［26］软件绘制基于群体间的Nei’s遗传距离的UPGMA（unweighted pair－group method with arithmetic mean，UPGMA）聚类树。