3种中药在体外对PEDV的抑制作用

摘要 ［目的］筛选抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）的有效中药单体及其作用节点。［方法］选择3种中药单体进行体外抗病毒试验，通过对病毒3个节点（抑制吸附穿入、直接杀灭、抑制复制）进行药物作用，评价CCK-8法、间接免疫荧光法和Western blot的对抗病毒效果。［结果］黄芩苷和水飞蓟在病毒吸附和穿入阶段抗病毒效果好，而诃子抗病毒效果较差；CCK-8测试显示，黄芩苷和水飞蓟最大抑制率分别为82.34%和78.00%，间接免疫荧光和Western blot进一步验证黄芩苷和水飞蓟能降低绿色荧光强度及抑制病毒N蛋白的表达，且2种药物抗病毒作用均呈现一定的浓度依赖性。［结论］该研究结果可为后续抗PEDV药物的筛选提供科学依据。

关键词 猪流行性腹泻病毒；中药；抗病毒作用

中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）09-0065-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.016

Abstract ［Objective］In order to screen effective traditional Chinese medicine monomers and their action nodes against PEDV.［Method］Three traditional Chinese medicine monomers were selected for in vitro antiviral test.Through the drug action on the three nodes of the virus （inhibition of adsorption penetration，direct killing，inhibition of replication），the antiviral effect was evaluated by CCK8 method，indirect immunofluorescence method and Western blot.［Result］The results showed that baicalin and silymarin had the best antiviral effect at the stage of virus adsorption and penetration，while chebula had a poor antiviral effect.CCK8 test showed that the maximum inhibition rates of baicalin and silymarin were 82.34% and 78% respectively.Indirect immunofluorescence and Western blot further verified that baicalin and silymarin could reduce the intensity of green fluorescence and inhibit the expression of viral N protein，and the antiviral effects of the two drugs showed a certain concentration dependence.［Conclusion］The results of this study can provide a basis for the subsequent screening of anti PEDV drugs.

Key words Porcine epidemic diarrhea virus;Traditional Chinese medicine;Antiviral effect

基金项目 芜湖市科技计划重点研发项目（2020yf50）。

作者简介 单雪芹（1987—），女，安徽蚌埠人，工程师，硕士，从事微生物与免疫学研究。

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的仔猪和育肥猪的一种急性肠道传染病。该病可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高［1］。PEDV暂无商品化特效治疗药物，主要依靠疫苗进行预防，但变异株的出现使疫苗保护力急剧下降，且弱毒疫苗存在一定的返强风险［2-3］。临床防治亦采用抗生素、激素等药物，但长期使用会导致致病菌耐药性增加和猪肉产品药物残留，降低疗效的同时增加公共卫生安全风险，严重危害人类健康［4-5］。我国中药资源丰富，且其具有低耐药性、低毒性、低残留等优点，目前已知较多中药具备增强免疫力及抗病毒作用［6］，大量研究亦表明，中药能有效防治 PEDV 引起的仔猪腹泻［7］。

中兽医学认为，猪 PED 属于外邪犯脾胃，毒邪湿气蕴积体内所致，而仔猪为稚阳之体，脾胃素弱，饲养不当、寒热不调等侵入均可导致脾胃功能失调而引发仔猪腹泻，因此可采用清热解毒、健脾祛湿、止泻收敛等治疗原则［8］。黄芪具有健脾补中，升阳举陷，益卫固表，利尿，托毒生肌的功效，主治脾气虚证、肺气虚证等［9］。诃子可涩肠止泻，敛肺止咳，常用于治疗久泻久痢，便血脱肛［10］。水飞蓟性味苦凉，有清热、解毒、保肝利胆作用［11］。3种药物从功效上看，均可对PED产生治疗作用，其中发酵黄芪多糖产物对PEDV疫苗诱导的免疫应答的增强作用已得到证实［12］，而诃子和水飞蓟对PEDV的影响鲜见报道。笔者选取 3 种中药进行体外抗 PEDV 研究，以期获得较好的抗 PEDV 的有效中药单体，为后续抗病毒药物的筛选提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和细胞。非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）、PEDV HS株由实验室保存。

1.1.2 主要试剂。

黄芩苷（HPLC≥85%）、水飞蓟（10∶1 提取物）、诃子（10∶1 提取物）均购自宝鸡市方晟生物开发有限公司；新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司；1M Tris-HCl、CCK-8 试剂盒、4%多聚甲醛固定液和RIPA 裂解液均购自上海碧云天生物技术有限公司；胰蛋白酶、DMEM、辣根过氧化物酶（HRP）化学发光底物均购自Thermo公司；PEDV N 蛋白单克隆抗体购自Medgene Labs 公司；FITC 标记山羊抗小鼠 IgG、小鼠抗 GAPDH 单克隆抗体、HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG均购自生工生物工程（上海股份有限公司）；脱脂牛奶、PBS、牛血清蛋白 V（BSA-Ⅴ）均购自北京索莱宝科技有限公司；Triton X-100购自北京酷来搏科技有限公司；彩色电泳蛋白 Marker（10-250 KDa）购自Bio-Rad 公司。

1.1.3 主要仪器。

细胞培养箱（Thermo Scientific 公司）；酶标仪、湿转膜装置、蛋白电泳仪（Bio-Rad 公司）；生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；倒置荧光显微镜（Nikon 公司）；脱色摇床（TS-100 海门麒麟医用仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 间接免疫荧光法测定 PEDV 病毒滴度。

选取生长状况良好的Vero细胞，消化后按100 μL/孔接种至96孔板内，置于37 ℃ 5% CO2条件下培养。将HS株用细胞维持液进行稀释，稀释度为10-1～10-10，待细胞长至90%时，弃去培养基，并将稀释好的病毒液按100 μL/孔接种至96孔板内，每个浓度设置8个重复，置于37 ℃ 5% CO2条件下培养72 h。

取出96孔板，弃生长液，按100 μL/孔加入4%多聚甲醛固定液，4 ℃固定30 min，用PBS 200 μL/孔洗涤3次，每次5 min；0.5% TritonX-100按100 μL/孔室温通透20 min，用相同方法洗涤；封闭液按100 μL/孔室温摇床封闭1h，用相同方法洗涤；加入一抗（1∶1 000 PBS稀释），50 μL/孔，4 ℃过夜孵育，用相同方法洗涤；加入荧光二抗（1∶100 PBS稀释），50 μL/孔，全程避光操作，室温摇床孵育1 h，用相同方法洗涤；加入适量PBS保持湿润；之后用荧光显微镜观察，记录荧光灶数目。按Reed-Muench两氏法计算TCID50。

1.2.2 中药单体最大无毒剂量的测定。

将中药溶解至DMSO中使其终浓度为100 mg/mL，用细胞维持液稀释中药使其终浓度为1 mg/mL（含1%DMSO），在此基础上进行倍比稀释。待96孔板铺满单层细胞，弃去培养基，按100 μL/孔向其加入稀释好的药液，每个浓度设置4个重复，另设正常细胞对照及含有1% DMSO对照，置于37 ℃ 5% CO2细胞培养箱培养96 h，用CCK-8法检测细胞存活率，细胞存活率大于90%的药物浓度即为该药物最大无毒剂量。

1.2.3 3种中药单体最佳作用浓度及作用节点的筛选。

试验选取黄芩苷、水飞蓟和诃子 3 种中药单体，分别通过 3 个作用节点（抑制吸附穿入、直接杀灭、抑制复制）进行体外抗 PEDV 试验，采用 CCK-8 法检测细胞 OD450 nm 值，并计算病毒抑制率。在药物最大无毒剂量范围内，用细胞维持液将药物倍比稀释成 4 个浓度（表1），分装待用。

1.2.3.1 中药对 PEDV 阻断作用的测定。

待 Vero 细胞单层时，弃细胞生长液，按100 μL/孔加入已稀释好的药液，每个浓度设置6个孔，37 ℃ 5% CO2 作用4 h，弃药液，按100 μL/孔加入 100 TCID50 PEDV，同时设立正常细胞及病毒对照，置于 37 ℃ 5% CO2作用2 h，弃病毒液，每孔加入100 μL细胞维持液，置于37 ℃ 5% CO2 培养96 h。之后采用 CCK-8 法检测细胞 OD450 nm 值，并计算病毒抑制率。

1.2.3.2 中药对 PEDV 直接杀灭作用的测定。

将稀释好的药液与100 TCID50 PEDV 混合，4 ℃作用4 h，然后按照100 μL/孔将混合液加入单层Vero细胞的96孔板内，每个药物浓度设置6个孔，同时设立正常细胞及病毒对照，37 ℃ 5% CO2 作用2 h，弃去混合液及病毒液，每孔加入100 μL细胞维持液，置于 37 ℃ 5% CO2 培养96 h。之后采用 CCK-8 法检测细胞 OD450 nm 值，并计算病毒抑制率。

1.2.3.3 中药对 PEDV 抑制作用的测定。

观察孔板内的Vero细胞，待细胞单层时，弃细胞生长液，按100 μL/孔加入100 TCID50 PEDV，37 ℃ 5% CO2 作用2 h，弃病毒液，按100 μL/孔加入已稀释好的药液，每个药物浓度重复6个孔，同时设立正常细胞及病毒对照，置于 37 ℃ 5% CO2 培养96 h。之后采用CCK-8法检测细胞OD450 nm值，并计算病毒抑制率。

1.2.4 有效抗病毒作用节点试验。筛选出对病毒抑制率大于50%的中药单体及药物作用节点。

1.2.4.1 间接免疫荧光法检测抗病毒作用。

将生长状况良好的细胞铺至96孔板，待孔底铺满单层细胞，弃培养基，按100 μL/孔加入已稀释好的药液，37 ℃ 5% CO2作用4 h，弃去药液，按100 μL/孔加入100 TCID50 PEDV，同时设立正常细胞组对照及病毒组对照，置于37 ℃ 5% CO2作用2 h，弃去病毒液，按100 μL/孔加入细胞维持液，置于37 ℃ 5% CO2培养16 h，弃细胞生长液，将单层细胞用于间接免疫荧光法检测。