鹅源酵母菌的分离鉴定及对污水COD的降解性能

摘要 ［目的］从鹅粪便中分离筛选具有生产潜能的酵母菌，为水质净化、畜禽粪便的资源化利用、动物养殖等提供菌种资源。［方法］使用麦芽汁培养基，采用涂布法和平板划线方法从鹅粪便中分离酵母菌，然后对纯化的菌种进行形态学、生理生化鉴定和26S rDNA序列的同源性分析进行鉴定。同时测定酵母菌对模拟污水COD的降解性能。［结果］分离到4株酵母菌，通过鉴定和系统发育分析，最终将分离到的菌株Y-1、Y-2、Y-3、Y-5分别鉴定并命名为阿氏丝孢酵母菌Y-1（Trichosporon asahii Y-1）、红酵母菌Y-2（Rhodotorula sp.Y-2）、胶红酵母菌Y-3（Rhodotorula mucilaginosa Y-3）、隐球酵母菌Y-5（Cryptococcus albidus Y-5）。4株酵母菌中，Y-3对模拟污水COD的去除效果最好，在菌浓度为1.5×109 CFU/mL、1%接种量、培养96 h时，对污水中COD的去除效果达到56.8%。［结论］筛选到4株酵母菌，其中胶红酵母菌Y-3对模拟污水COD的去除效果最好，可进一步用于后续研究。

关键词 酵母菌；分离鉴定；系统发育分析；COD降解

中图分类号 X703  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）10-0005-05

Abstract ［Objective］To isolate and screen yeast with production potential from goose feces，and provide bacterial resources for water purification，resource utilization of livestock and poultry feces and animal breeding.［Method］Yeasts were isolated from goose feces using the wort medium by the plate coating method and the streak plate method，and according to morphological，physiological and biochemical ，26S rDNA sequence analysis.At the same time，it was measured that the degradation performance of the yeast for COD in simulated sewage.［Result］The four isolated yeast strains Y1，Y2，Y3 and Y5 were finally named as Trichosporon asahii Y1，Rhodotorula sp.Y2，Rhodotorula mucilaginosa Y3，Cryptococcus albidus Y5 through identification and phylogenetic analysis.Among the 4 strains of yeast，Rhodotorula mucilaginosa Y3 had the best removal effect on COD in simulated sewage，and the removal rate reached 56.8% when the bacterial concentration was 1.5×109 CFU/mL，1% inoculum and cultured for 96 h.［Conclusion］Four strains of yeasts were screened，among which Rhodotorula mucilaginosa Y3 had the best removal effect on COD in simulated sewage，which could be further used in subsequent studies.

Key words Yeast;Isolation and identification;Phylogenetic analysis;COD degradation

酵母菌是一种结构简单的、兼性厌氧型单细胞微生物，菌体中富含动物和人体所必需的多种氨基酸、糖类、蛋白质、维生素等［1］。酵母菌在动物生产中作为益生菌，不仅能恢复肠道的微生态平衡，而且有助于肠道形态的生长和发育［2-3］。齐琼［4］研究表明海洋红酵母菌的添加不仅对虾的增重率、饵料系数等均有提高，还可改善肠道菌群，增加虾壳的虾青素和抵抗力。唐微微等［5］所分离的2株酵母菌具有一定除臭作用，两菌复合后对猪粪便中的氨气和硫化氢的去除率增加。惠文森等［6］研究发现，酵母菌可提高发酵玉米秸秆粗蛋白、粗脂肪的含量，但对粗纤维作用甚微；而刘晓辉等［7］从土壤中分离出的一株胶红酵母菌则对纤维素有一定的降解能力。此外，酵母菌还对水质有较大的净化作用，较好地应用在有毒废水、高浓度有机废水以及生活废水中，对重金属离子具有一定的清除效果［8-9］。

动物肠道中的真菌在正常菌群中所占比例极小，但在维持肠道微生态平衡和机体健康中发挥重要作用。该试验旨在从鹅的新鲜粪便中分离筛选有益的酵母菌并对其进行鉴定和分析，以便为水质净化、动物饲料添加剂开发、秸秆腐熟以及动物粪便除臭等方面的研究提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集。该试验中所用的鹅的新鲜粪便采集于洛阳师范学院伊滨校区月明湖畔。采集粪便时，除去其表面的杂草和泥土，取中间部分，装封口塑料袋中，排气封口，编号，放入干净的泡沫盒中迅速带回实验室并进行酵母菌的分离。

1.1.2 培养基配制。

（1）麦芽浸粉琼脂培养基。称取成品的麦芽浸粉琼脂33.6 g，加热煮沸溶解于1 000 mL蒸馏水中，分装，121 ℃高压灭菌15 min，用作酵母菌的分离筛选［10］。

（2）YPD培养基。酵母粉10 g/L、蛋白胨 20 g/L、葡萄糖20 g/L，若制固体培养基，加入1.7%琼脂粉，121 ℃高压灭菌15 min，用作酵母菌的培养和纯化［5］。

1.1.3 模拟污水的制备。

模拟污水的配制参照黄秋婷等［11］的方法进行。通过测定，模拟污水化学需氧量（COD）为513.07 mg/L。

1.2 试验方法

1.2.1 鹅粪便的预处理。

称取采集的鹅粪便5.0 g，转移至无菌的锥形瓶中，加入100 mL灭菌的蒸馏水，于30 ℃、150 r/min 条件下在摇床中振荡30 min后，静置20 min后用于酵母菌的分离。

1.2.2 酵母菌的分离纯化。

取“1.2.1”中一定量的粪便稀释液样品进行梯度稀释，分别从 10-2、10-3、10-4稀释度下吸取 0.1 mL 于麦芽浸粉琼脂平板上涂布，30 ℃条件下在恒温培养箱培养2 d。挑取单菌落，进一步用平板划线法在YPD固体培养基上划线纯化培养2～3次，然后进行斜面保存和-20 ℃下甘油保存。

1.2.3 酵母菌的鉴定方法。

1.2.3.1 形态学特征和生理生化鉴定。参照《酵母菌的特征与鉴定手册》［12］，采用糖发酵试验、氮源同化试验、碳源同化试验等进行酵母菌种属的鉴定。

1.2.3.2 分子生物学鉴定。按照《分子克隆实验指南》［13］的方法提取酵母菌基因组DNA，根据 26S rDNA的D1/D2 区序列合成的一对保守引物（NL1-F：5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′，NL4-R： 5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG GG-3′）［5，7］，然后对酵母菌的26S rDNA 的D1/D2 区序列进行PCR扩增。PCR扩增条件：预变性 95 ℃ 5 min；随后进行30个循环的变性 95  ℃ 30 s，退火30 s，延伸40 s;最后在 72  ℃下延伸5 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后委托上海生工生物工程股份有限公司测序。将测序结果在NCBI中进行Blast，分析并下载与待鉴定菌株26S rDNA相似性高的序列，利用Clustal X软件和Mega 6.0软件进行序列比对和构建系统发育树［7］。

1.2.4 分离菌株对模拟污水降解性能的测定。

将初筛的纯化好的各菌液浓度调至OD600=0.5左右，按1%接种量接种至盛有100 mL模拟污水的三角瓶中，在30 ℃、150 r/min 振荡培养48 h取上清液测定模拟污水的COD含量，计算各菌株对模拟污水中COD的去除效果。对照组接种同量的灭菌发酵液。

1.2.5 试验菌株在不同浓度和培养时间下对模拟污水COD的去除能力。

根据各菌株对模拟污水COD的去除效果，选择去除效果最好的菌株进一步研究。该试验中，除对照组（CG）外，共分为4个试验组，即试验组1（EG1，各菌的原液，浓度为1.5×109 CFU/mL）、试验组2（EG2，浓度为5.0×108 CFU/mL）、试验组3（EG3，浓度为3.0×108 CFU/mL）、试验组4（EG4，浓度为1.5×108 CFU/mL）。按 1%的接种量接种到模拟污水中，于 30 ℃下150 r/min 振荡培养，分别在24、48、72、96 h取样测定模拟污水的COD含量。对照组接种同量的灭菌发酵液。

1.3 数据分析 试验数据在Excel中进行分析整理，然后用SPSS 19.0统计分析软件进行分析，采用 Dancan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 鹅源酵母菌的分离纯化及形态学特征

通过使用麦芽汁琼脂培养基对鹅粪便中酵母菌的分离，挑取单一的乳白色、红色菌落在YPD固体培养基上进行划线纯化培养，根据其生长快慢，最终从鹅粪便样品中共分离纯化出4株疑似酵母菌的菌株，分别标号为Y-1、Y-2、Y-3、Y-5（图1），其菌落形态特征描述见表1。

2.2 菌株的生理生化鉴定

试验所分离的酵母菌经生理生化鉴定，发现4株都能在28～37 ℃条件下生长，且对糖类都发酵，其具体结果见表2。

2.3 菌株分子生物学鉴定

以酵母菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增其26S rDNA的D1/D2 区序列，用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，均扩增到一清晰的600 bp左右的条带（图2）。测序结果显示，Y-1、Y-2、Y-3、Y-5菌株的26S rDNA D1/D2 区序列长度分别为611、584、575和585 bp，与预期结果基本相符合。

将测序的序列在NCBI中进行Blast分析，结果见表3。各菌株的26S rDNA的D1/D2 区序列与NCBI中相应模式菌株26S rDNA序列的相似性均达到了97%及以上。从构建的系统发育树结果（图3）来看，Y-1的26S rDNA序列与Trichosporon asahii CLIB 3029（LT627403.1）的同源性达到100%，菌株Y-2与Rhodotorula sp.CRUB 1485 （EF585198.1）的序列同源性达到了97%，菌株Y-3与Rhodotorula mucilaginosa lhWW25 （MF448272.1）的同源性达到98%，菌株Y-5与Cryptococcus albidus YM2518 （KT345310.1）的同源性达到了100%。