巨大芽孢杆菌应用于改善茄芯香气品质的研究

摘要 为降低茄芯烟叶中木质素含量、改善烟叶品质，从烟叶提取液中筛选出一株具有木质素降解能力的菌株，鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。其中木质素过氧化物酶活性达到19.03 U/L，锰过氧化物酶活性达到4.35 U/L。使用该菌株进行茄芯烟叶发酵，通过单因素试验及中心组合响应面法优化，得到最佳工艺条件：接种量7%、发酵温度37 ℃、起始含水量25%、发酵时间6 d。在此最佳条件下，茄芯烟叶木质素降解率达到23.02%，且发酵后中性香气总量较发酵前提高了30.22%。

关键词 巨大芽孢杆菌；茄芯烟叶；木质素降解酶；响应面试验；中性香气

中图分类号 Q815  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）10-0010-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.003

Abstract In order to reduce the lignin content in filler tobacco leaves and improve the quality of tobacco leaves， a strain with lignindegrading ability was screened from tobacco leaf extract and identified as Bacillus megaterium. Among them， the enzymatic activity of lignin peroxidase reached 19.03 U/L， and the enzymatic activity of manganese peroxidase reached 4.35 U/L. The strain was used to ferment cigar tobacco leaves， and the optimal process conditions were obtained through single factor experiment and central combined response surface methodology optimization： the inoculum size was 7%， the fermentation temperature was 37 ℃， the initial water content was 25%， and the fermentation time was 6 d. Under this optimal condition， the degradation rate of lignin in cigar tobacco leaves reached 23.02%， and the total amount of neutral aroma after fermentation was increased by 30.22% compared with that before fermentation.

Key words Bacillus megaterium;Cigar filler leaves;Lignin degrading enzyme;Response surface experiment;Neutral aroma

木质素是烟草细胞壁的重要组成部分［1-2］，在烟叶中的含量为7%～9%。木质素也是一种苯基丙烷类生物大分子，它通过氢键和共价键与纤维素和半纤维素紧密结合，共同形成了细胞壁致密的网状结构［3］。木质素结构复杂，具有一定的机械强度，难以降解［2］。细胞壁物质对雪茄烟的抽吸口感以及品质影响相当大，在雪茄点燃抽吸过程中木质素由于热解会产生儿茶酚、烷基儿茶酚等产物，这些产物会引起涩口，并且有致癌风险［3］。因此，降低烟叶中木质素含量，对改善雪茄品质至关重要。

研究表明木质素降解常用的方法包括微生物降解、外源添加酶制剂降解［4］。但由于木质素致密的网状结构导致外源酶制剂在处理烟叶时很难通过细胞壁，这就给酶法降解烟叶中的木质素带来了一定的难度［3］。相对于酶法降解木质素，改善烟叶品质，微生物处理更高效［5］。截至目前，发现的能降解木质素的菌株主要是真菌、细菌、放线菌等。相对于真菌，细菌更容易培养，且来源广泛。因此，细菌更适应烟叶发酵的环境［6-7］。另外，烟叶中低糖、高尼古丁的环境也决定了真菌在烟叶中很难存活，近年来对于木质素降解的研究也大多是细菌［2］。如李灵灵等［8］从土壤中筛选出一株变色栓菌，该菌可降解水稻秸秆中35%的木质素；Xu等［9］研究了细菌对木质素的解聚和利用，发现巨大芽孢杆菌可降解堆肥土壤中的木质素。但是，目前木质素降解菌在雪茄烟叶发酵中的应用鲜见报道。

该研究从烟叶提取液中筛选得到一株不仅可以产木质素降解酶的巨大芽孢杆菌，还可产淀粉酶、蛋白酶。将该菌应用于雪茄烟叶的发酵，探究该菌株对雪茄烟叶发酵后的木质素降解率、香气成分含量的影响，为工业生产中提高雪茄烟叶发酵品质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟叶来自湖北恩施州晾制结束的CX-014雪茄茄芯烟叶。

烟叶提取液来自湖北省烟草科学研究院。

初筛培养基：碱性木质素2 g/L、硫酸铵1.33 g/L、硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、磷酸氢二钠0.2 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

LB-苯胺蓝培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L、苯胺蓝0.1 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

亮蓝-BM培养基：酵母膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、亮蓝0.1 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.0，115 ℃灭菌30 min。

碱性木质素培养基：碱性木质素2 g/L、硫酸铵1.33 g/L、硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、磷酸氢二钠0.2 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

产酶培养基：葡萄糖4 g/L、碱性木质素2 g/L、硫酸铵1.33 g/L、硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、磷酸氢二钠0.2 g/L，pH 7.0，115 ℃灭菌30 min。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 木质素降解菌株的筛选。

1.2.1.1

初筛。取烟叶提取液5 mL，在无菌条件下，用无菌生理盐水进行梯度稀释，取10-3、10-4、10-5的稀释液各100 μL涂布到初筛培养基中，37 ℃培养24 h，挑选生长良好、形态差异明显的菌落反复划线进行分离纯化，挑取纯化后的单菌落经液体培养富集，然后使用终浓度为25%的甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.1.2

复筛。将初筛得到的单菌落接种于LB-苯胺蓝培养基和亮蓝-BM培养基中，37 ℃培养，观察菌落周围颜色变化，以平板中菌落周围是否有脱色圈来定性检测与木质素降解有关的木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，Lip）、锰过氧化物酶（manganese peroxidase，Mnp）、漆酶（laccase，Lac）。其中苯胺蓝的脱色与木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶有关［10］，漆酶与亮蓝的脱色有关［10］。

1.2.2 菌株的鉴定。

将待测菌株在LB培养基中培养至对数期，收集菌体，使用细菌DNA提取试剂盒（TIANGEN DP302）提取细菌DNA。以该DNA为模板，使用引物27F/1492R 进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证后将PCR产物送至武汉昆泰锐生物技术有限公司测序，将得到的序列在NCBI数据库中比对，且用Mega 11.0.8软件绘制系统发育树，判断该菌株的属别。

1.2.3 木质素降解酶活性的测定。

根据Niladevi等［11-12］的方法测定漆酶活性。

根据Tien等［13］的方法测定木质素过氧化物酶活性。

根据Kapich等［14-15］的方法测定锰过氧化物酶活性。

1.2.4 雪茄烟叶发酵。

1.2.4.1 雪茄烟叶固态发酵。

参照覃明娟等［16］的方法并进行适当的调整。将供试烟叶进行切丝，宽度为2 mm左右，称取30 g于250 mL三角瓶中，将筛选得到的木质素降解菌经LB培养基活化后接种于产酶培养基中，培养至对数生长期（按烟丝重量确定接种量），离心取菌体，加入等体积的无菌水进行重悬，得到重悬液，将重悬液与营养液（按烟丝重量添加1%谷氨酸、2%葡萄糖）混合后，均匀地喷洒在烟丝上，平衡水分，放入恒温恒湿培养箱中发酵6 d，保持恒温恒湿箱温度一定，湿度为80%，发酵结束后75 ℃烘干烟丝，过40目孔径筛。

1.2.4.2 响应面优化。

以接种量、发酵温度、起始含水量为考察因素，设计3因素3水平的中心组合试验，以木质素降解率为响应值，得到降解烟叶中木质素的最佳试验方案。

1.2.4.3 烟丝中木质素含量的测定。

采用克拉森木素法［17］，将发酵后的烟丝75 ℃烘干，粉碎后过40目孔径筛，称取2 g粉末于索氏抽提装置中，用苯醇抽提至液体为无色，将抽提好的样品于105 ℃烘至绝干，取0.3 g于小烧杯中，准确加入浓度为72%的硫酸3 mL，充分润湿混匀，30 ℃水浴2 h，15 min 搅拌一次，将反应后的样品用84 mL蒸馏水洗涤转移到100 mL无菌瓶中，123 ℃蒸煮1 h后，冷却至室温，抽滤并将固体木质素pH洗至中性，105 ℃烘至恒重，称量烘干后的样品重量。

1.2.4.4 蒸馏萃取（SDE）-气质联用（GC-MS）测定烟草致香物质成分。

参考Yao等［18］的方法测定烟草中致香物质成分。

1.3 数据处理

所有试验均设置3个平行，采用Origin 2019作图、Mega 11.0.8构建系统发育树、Design expert 10进行响应面分析、TBtools软件进行热图绘制。

2 结果与分析

2.1 木质素降解菌株的筛选和鉴定

从烟叶提取液中筛选得到一株具有木质素降解能力的菌株，将得到菌株命名为m1。随后，经LB-苯胺蓝培养基和亮蓝-BM培养基复筛，如图1所示，发现该菌在LB-苯胺蓝培养基中能够产生明显的脱色圈，而在亮蓝-BM培养基中无脱色圈。说明该菌株具有产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的能力，而无产漆酶能力。

为进一步确定该菌株的属别对该菌株进行16S rDNA测序，将测序得到的序列在NCBI上进行比对，选取结果中相似度较高的菌株作为参考菌株绘制系统发育树（图2）。由图2可知，菌株m1的16S rDNA的基因序列与芽孢杆菌属中的巨大芽孢杆菌相似度最高，为100%，初步确定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），命名为Bacillus megaterium m1。

2.2 木质素降解酶活性的检测

为进一步验证Bacillus megaterium m1产酶能力，该研究使用产酶培养基对其进行培养，检测木质素降解酶的活性。Bacillus megaterium m1分泌3种酶的活性见图3，结果表明B.megaterium m1具有较强的产木质素过氧化物酶（Lip）的能力，24 h时该酶的活性达到19.03 U/L。但该菌株分泌锰过氧化物酶（Mnp）的能力较弱，培养24 h时该酶的活性仅有4.35 U/L。整个过程中基本没有检测到漆酶（Lac）活性。