蕨麻单宁的分离纯化及抗氧化活性研究

摘要 采用大孔吸附树脂法和有机溶剂萃取法对蕨麻块根中单宁成分进行分离纯化，并考察不同纯化方法下得到单宁样品对DPPH·和·OH的清除能力。结果表明，大孔树脂纯化蕨麻单宁的最佳工艺条件：选用X-5型大孔树脂，上样流速为1.0 mL/min，上样液浓度为1.01 mg/mL，洗脱液为60%乙醇溶液，洗脱流速为1.5 mL/min。乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯萃余物、大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃取经大孔树脂纯化物和乙酸乙酯萃余经大孔树脂纯化物的纯度分别为36.65%、34.87%、59.72%、81.09%、80.43%。在样品浓度为0.05 mg/mL时，粗提液和上述样品对DPPH·的清除率分别为77.50%、93.01%、82.03%、88.63%、74.21%、79.52%；在样品浓度为0.50 mg/mL时，粗提液和上述样品对· OH的清除率分别为72.09%、60.88%、64.78%、76.55%、58.38%、67.94%。

关键词 蕨麻；单宁；分离纯化；抗氧化活性；大孔吸附树脂

中图分类号 R 284  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）12-0142-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.033

Study on Isolation，Purification and Antioxidant Activities of Tannins of Potentilla anserina

QU Jun-ru1，2，3， LI Jun-qiao1，2，3，TIAN Tian1，2，3 et al

（1.College of Ecological Environment and Resources， Qinghai Nationalities University，Xining，Qinghai 810007;2.Qinghai Plateau Crop Germplasm Resources Research and Utilization Laboratory，Xining，Qinghai 810007;3.Key Laboratory of High-value Utilization of Characteristic Economic Plants， Qinghai Province，Xining，Qinghai 810007）

Abstract The macroporous adsorption resin method and organic solvent extraction method were used to separate and purify the tannin components from root tuber of Potentilla anserina， and the scavenging ability of tannin samples obtained under different purification methods for DPPH· and·OH was investigated.The result showed that the optimal process conditions for purifying the tannin from root tuber of Potentilla anserina with macroporous resin： select X-5 macroporous resin， the flow rate of sample was 1.0 mL/min， the feed concentration of sample was 1.01 mg/mL， the desorption solvent was 60% ethanol solution， and the flow rate was 1.5 mL/min.The purity of ethyl acetate extract， ethyl acetate residue， macroporous resin purification， ethyl acetate extract purified by macroporous resin， and ethyl acetate residue purified by macroporous resin were 36.65%， 34.87%， 59.72%， 81.09% and 80.43%， respectively.At a sample concentration of 0.05 mg/mL， the scavenging rates of the crude extract and the above samples for DPPH· were 77.50%， 93.01%， 82.03%， 88.63%， 74.21% and 79.52%， respectively;at a sample concentration of 0.50 mg/mL， the scavenging rates of crude extract and the above samples for·OH were 72.09%， 60.88%， 64.78%， 76.55%， 58.38% and 67.94%， respectively.

Key words Potentilla anserina;Tannins;Isolation and purification;Antioxidant activity;Macroporous resin

基金项目

青海省自然科学基金计划-创新团队项目（2022-ZJ-902）；青海民族大学研究生创新项目（54M2021004）。

作者简介 曲俊儒（1997—），女，辽宁沈阳人，硕士研究生，研究方向：植物资源开发与利用。*通信作者，教授，博士，博士生导师，从事植物资源开发与利用研究。

收稿日期 2022-12-18

蕨麻（Potentilla anserina L.）为鹅绒委陵菜的变种，属蔷薇科（Rosacrae）委陵菜属（Potentilla），广泛分布于我国青海、西藏等高海拔地区，其块根中富含多种活性成分，具有广阔的科研前景。蕨麻块根中分离得到的野蔷薇苷、刺梨苷等单体成分，已证实具有较好的抗疲劳和抗缺氧作用［1-2］。单宁多存在于植物的茎、叶、表皮、果实等组织中，一般分为缩合单宁和水解单宁两大类［3］，是一种分子量为500～3 000 Da的多元酚类次生代谢物［4］。单宁类化合物具有多种药理作用，如抗菌、抗氧化、抗过敏、抗炎、抗癌、抗哮喘、免疫调节等［5-7］，还可以阻碍单纯疱疹病毒（HSV）和艾滋病毒（HIV）对营养物质的吸收和细胞病变［4，8］。其中没食子单宁和鞣花单宁可作口服剂用于抑制艾滋病（AIDS），效果优于合成的AIDS药物［9-10］;鞣花酸单宁和部分原花青素还可以作为逆转录酶抑制剂，抑制乙型肝炎病毒感染细胞中E抗原的分泌［11］。此外，单宁类化合物还被广泛应用于食品添加剂、胶黏剂、皮革、动物饲料等行业；因其独特口感在葡萄酒、茶、咖啡等饮料产品的研发中也有着不可替代的作用［12］。

目前，蕨麻中活性成分（总黄酮、总生物碱、多糖、皂苷）和营养成分（淀粉、粗蛋白、氨基酸、粗纤维、维生素、矿质元素）等方面的研究均已较为完善，对其中单宁成分的研究仍较少，尚未进行分离纯化等相关工作［13-23］。常见的单宁纯化方法有大孔吸附树脂法、膜分离法、萃取分离法、色谱法等，其中大孔树脂法因其成本低、耗能小、操作简单等优点被大量应用于工业生产中［24-27］。因此，该试验采用大孔吸附树脂纯化法、乙酸乙酯萃取分离法及二者联用方法对蕨麻块根中单宁成分进行分离提纯，并考察不同纯化方法得到单宁的抗氧化活性，建立高效简便的蕨麻单宁纯化工艺流程，为后续进一步研究提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材与试剂。蕨麻块根，2021年9月采自青海省西宁市湟源县蕨麻种植基地；钨酸钠；钼酸钠；磷酸；盐酸；硫酸锂；无水碳酸钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；单宁酸标准品；1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）；抗坏血酸，上海源叶生物科技有限公司；X-5、D101、HP-20、HPD-400、S-8、HPD-826型大孔树脂，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 仪器。UV-5500型紫外-可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；Neofuge23Ｒ台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；BT102S微型蠕动泵，保定雷弗流体科技有限公司；SHT-40A超声波清洗器，深圳市深华泰超声清洗设备有限公司；HZQ-X160恒温震荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司；RE101-Pro旋转蒸发仪，大龙兴创试验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蕨麻块根单宁提取。

1.2.1.1 脱脂蕨麻粉末的制备。

取新鲜青海蕨麻3号块根于恒温干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎过筛（60目），称取适量干燥蕨麻粉末置石油醚（1∶4）中常温浸泡48 h，待粉末脱脂后减压回收石油醚，得到蕨麻供试粉末，干燥密封保存备用。

1.2.1.2 蕨麻粗提液的制备。

精密称取已预处理的蕨麻供试粉末，加入50%乙醇溶液（1∶20），于超声功率800 W、温度60 ℃条件下提取90 min，过滤，得到蕨麻块根粗提液，保存备用［28-30］。

1.2.2 单宁的定性及定量分析。

1.2.2.1 定性分析。

取适量粗提液和单宁酸标准液分别进行单宁的FeCl3颜色反应、明胶沉淀反应和甲醛-盐酸共沸沉淀反应，对蕨麻块根粗提液中单宁成分进行初步定性分析。

1.2.2.2 定量分析。

精密称取10.20 mg单宁酸标准品于500 mL 容量瓶中，依次吸取5、10、15、20、25、30 mL于50 mL容量瓶中定容，得到0.002 04、0.004 08、0.006 12、0.008 16、0.010 20、0.012 24 mg/mL系列浓度的单宁酸溶液，采用钨酸钠-钼酸钠法［27］显色，于最大吸收波长处测定系列标准溶液吸光度。以单宁酸标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取定量粗提液稀释后依上述方法显色测定吸光度，根据线性方程及公式（1）［31］计算单宁得率（W）。

W=V×c×V1M×V2×103×100%（1）

式中，V为稀释用容量瓶的体积（mL）；c为单宁含量（mg/mL）；V1为提取液总体积（mL）；V2为稀释液体积（mL）；M为蕨麻块根供试粉末的质量（g）。

1.2.3 蕨麻单宁的分离与纯化。

1.2.3.1 大孔树脂的静态筛选。

称取已预处理的D101、X-5、S-8、HP-20、HPD-400、HPD-826型树脂各2 g，分别装入150 mL锥形瓶中，然后加入40 mL质量浓度为0.81 mg/mL单宁粗提液，置于摇床中（30 ℃、110 r/min），振荡吸附24 h后抽滤，适量蒸馏水清洗2次，然后用60%乙醇40 mL对树脂进行振荡解吸，分别测定滤液及解吸液中单宁含量。按照公式（2）～（4）分别计算大孔树脂的吸附率、吸附量及解吸率。

1.2.3.2 洗脱剂浓度对树脂静态解吸的影响。称取已预处理的X-5型大孔树脂2 g（共6份），装入150 mL锥形瓶中，加入40 mL质量浓度为0.81 mg/mL单宁粗提液，置于摇床中（30 ℃、110 r/min），振荡吸附24 h后抽滤，适量蒸馏水清洗2次，然后用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇40 mL对树脂进行振荡解吸，分别测定滤液及解吸液中单宁的含量，计算不同溶液浓度下树脂的解吸率。