参豉糖蛋白提取工艺优化及纤溶活性研究

摘要 ［目的］对参豉中糖蛋白的提取工艺进行考察，并对其纤溶活性进行评价。［方法］以糖蛋白提取率为指标，通过单因素法考察缓冲液、提取温度、料液比、提取时间和提取次数对其的影响，并运用响应面法分析优化参豉糖蛋白的提取工艺，采用蒽酮-硫酸法测定糖蛋白中多糖含量，SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳确定糖蛋白的分子量，利用琼脂糖纤维蛋白平板法测定纤溶活性。［结果］缓冲液、提取时间和料液比对糖蛋白提取率影响较大；响应面法优化获得参豉糖蛋白的最佳提取工艺条件为Tris-Base-NaCl缓冲溶液（pH=8.04）、料液比1∶10（g∶mL），于4 ℃提取6 h，参豉糖蛋白提取率为4.85%，其中多糖含量为12.34%；SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，参豉糖蛋白分子量为4.1～27.0 kD；与豆豉糖蛋白相比，参豉糖蛋白纤溶活性提高了40.6%。［结论］经验证利用响应面法分析测得参豉糖蛋白与模型预测值接近，可用于参豉糖蛋白的提取，且参豉糖蛋白具有较高的纤溶活性，为其进一步开发利用提供依据。

关键词 参豉；糖蛋白；提取工艺；优化；响应面法；蛋白质分子量；纤溶活性

中图分类号 R 284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）12-0147-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.034

Study on Extraction Process Optimization and Fibrinolytic Activity of Glycoprotein from Ginseng-douchi

SONG Ji-peng，SUN Yin-ling，DING Chun-jie et al

（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin，Heilongjiang 150036）

Abstract ［Objective］ The extraction process of glycoprotein in ginseng-douchi was investigated，and its fibrinolytic activity was evaluated.［Method］Taking the glycoprotein extraction rate as an index， the effects of buffers， extraction temperature， solid-liquid ratio， extraction time and extraction times were investigated by one-way method， and optimize the extraction process of ginseng-douchi glycoprotein by the response surface method.The polysaccharide content in glycoproteins was determined by anthraconone-sulfuric acid method，the molecular weight of glycoproteins was determined by SDS-PAGE and Tricine-SDS-PAGE gel electrophoresis， and its fibrinolytic activity was determined by agarose fibrin plate method.［Result］ The buffers， extraction time and solid-liquid ratio had a greater impact on glycoprotein extraction rate. The optimal extraction process conditions for obtaining ginseng-douchi glycoprotein were optimized by the response surface method：Tris Base NaCl buffer solution （pH=8.04）， solid-liquid ratio 1∶10 （g∶mL）， and extracted at 4 ℃ for 6 hours，the extraction rate of ginseng-douchi glycoprotein was 4.85%， and the polysaccharide content in ginseng glycoprotein was 12.34%. SDS-PAGE and Tricine-SDS-PAGE gel electrophoresis results showed that the molecular weight of ginseng-douchi glycoprotein was 4.1-27.0 kD; compared with ginseng-douchi glycoprotein， the fibrinolytic activity of ginseng-douchi glycoprotein increased by 40.6%.［Conclusion］ After verification， the ginseng-douchi glycoprotein measured by the response surface method is close to the predicted value of the model， which can be used for the extraction of ginseng-douchi glycoprotein， and ginseng-douchi glycoprotein has a high fibrinolytic activity， which provides a basis for its application.

Key words Ginseng-douchi; Glycoprotein; Extraction process;Optimization;Response surface methodology; Protein molecular weight;Fibrinolytic activity

基金项目 国家自然科学基金项目（U20A20400）；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-21）；黑龙江省财政专项（CZKYF-2021A002）；黑龙江省卫生健康委课题（20211313050162）。

作者简介 宋吉鹏（1997—），男，山东青岛人，硕士研究生，研究方向：中药生物工程。

收稿日期 2022-09-29；修回日期 2022-11-23

参豉是依据《圣济总录》中记载的阿胶饮方，以人参和黄豆作为发酵基质，采用枯草芽孢杆菌发酵制成的新型豆豉。前期已对参豉发酵前后人参皂苷和异黄酮糖苷类成分的生物转化进行了研究，并发现黄豆加入人参发酵后纤溶活性明显升高，且具有降低血脂水平、调节脂质紊乱的作用［1-3］。此外，人参和黄豆中分别含有约12%和30%的蛋白质［4-5］，而蛋白质在发酵过程中易被微生物分泌的蛋白酶降解为多肽而表现更好的生理活性。研究表明，80%以上蛋白质为糖蛋白，糖蛋白是一种由多肽链和低聚糖链共价结合而成的生物大分子，具有抗凝、溶栓、降低胆固醇、抗氧化等生物活性［6］，经预试验发现参豉糖蛋白具有较高的纤溶活性，可能为其益气活血作用的药效物质基础之一。因此该研究对参豉糖蛋白的提取工艺进行优化，并对其分子量及纤溶活性进行考察，为其进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1

试材。黄豆购于和粮农业有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为豆科植物大豆［Glycine max（L.）Merr.］的干燥成熟种子；人参（5年生）购自吉林省百济堂参业有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为五加科植物人参（Panax Ginseng C.A.Mey.）的干燥根。

1.1.2 试剂。Tris-Base，Biosharp公司；Tris-HCl、PBS，北京中杉金桥；琼脂糖、蛋白非预染Marker，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；纤维蛋白原，北京博奥拓达科技有限公司；凝血酶，中国食品药品检定研究院；BCA蛋白质定量试剂盒、小分子量蛋白凝胶制备试剂盒、高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒、SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶制备试剂盒、小分子蛋白凝胶制备试剂盒、2X Tricine上样缓冲液、蛋白非预染Marker，上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备。FD-1D-80+型真空冷冻干燥机，北京博医康公司；042BR10580型电泳仪，Bio-Rad公司；BSA224S-CW型电子天平，北京奥利多斯科学仪器有限公司；S210-K型pH计，美国梅特勒-托利多公司；603BR1415型凝胶成像系统，Bio-Rad公司；M200型酶联免疫检测仪，瑞士Tecan公司；MF3型菌落分析仪，杭州迅数科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 参豉的制备。参照孙银玲等［7］关于参豉的制备方法，人参和黄豆的质量比为1∶10，以人参水提液浸泡黄豆，待提取液吸收殆尽，灭菌后作为发酵基质，接种枯草芽孢杆菌菌液，于28 ℃发酵96 h，即得参豉样品，经冷冻干燥、粉碎为粗粉，采用石油醚脱脂后进行后续试验。

1.2.2 蛋白标准曲线的绘制。采用水合茚三酮（bicinchoninic acid，BCA）法［8］测定糖蛋白的浓度，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为标准品，倍比稀释分别得到1 600、800、400、200、100、50、25 μg/mL的BSA系列标准溶液。按试剂盒说明操作，于562 nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标、蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.000 5x+0.096 1（R2=0.995 9）。

1.2.3

参豉糖蛋白样品浓度的测定。用生理盐水将糖蛋白提取液稀释20倍，按照“1.2.2”的方法及波长检测各样品的吸光度，根据标准曲线计算样品中糖蛋白浓度并计算提取率。

糖蛋白提取率=V×C×Dm×1 000×100%

式中，V为样品溶液的总体积（mL）；C为样品糖蛋白浓度（mg/mL）；D为稀释倍数；m为称取样品质量（g）。

1.2.4 单因素考察糖蛋白提取率。

1.2.4.1 缓冲液对参豉糖蛋白提取率的影响。配制3种不同pH的缓冲溶液体系：Tris-HCl（25 mmol/L）-NaCl（50 mmol/L）（pH=5.90 mol/L）、PBS（10 mmol/L）（pH=7.30）、Tris-Base（25 mmol/L）-NaCl（50 mmol/L）（pH=8.04）。精密称取参豉粗粉3份各1 g，分别加入3种缓冲液各10 mL，室温浸提6 h，每15 min涡旋振摇一次，在室温条件下于4 200 r/min离心10 min，取上清液再于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液即为参豉糖蛋白粗提液，检测糖蛋白浓度，计算提取率，确定最佳提取缓冲溶液。

1.2.4.2 提取温度对参豉糖蛋白提取率的影响。精密称取参豉粗粉3份各1 g，加入“1.2.4.1”确定的最佳提取缓冲液，其他参数不变，分别于4、25、35、45、60 ℃提取6 h，确定最佳提取温度。

1.2.4.3 料液比对参豉糖蛋白提取率的影响。在最佳提取缓冲液和提取温度的条件下，考察料液比1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）对参豉糖蛋白提取率的影响。