水牛ACSL基因家族全基因组及表达分析

摘要 为鉴定水牛长链脂酞辅酶A合成酶（long-chain fatty Acyl-CoA synthetases，ACSLs）的家族成员并探究该基因家族在泌乳方面的功能，通过生物信息学技术对水牛ACSL基因家族进行了motif、基因结构分析、共线性分析、不同物种系统进化分析，运用qPCR技术检测ACSLs在不同组织的mRNA表达量。结果表明：水牛ACSL基因家族共有5个家族成员并分别命名为bbu.ACSL1、bbu.ACSL3、bbu.ACSL4、bbu.ACSL5和bbu.ACSL6。染色体分布情况结果显示：bbu.ACSL1位于1号染色体，bbu.ACSL3位于2号染色体，bbu.ACSL4位于25号染色体，bbu.ACSL5位于23号染色体，bbu.ACSL6位于9号染色体。这5个ACSL氨基酸数在699～722 aa，所有蛋白的等电点除ACSL6外均大于7.00。Motif分析发现，除ACSL3和ACSL4缺少motif8外，其余均含有预测出的Motif 1～10，且排序相同。物种内共线性分析结果显示，水牛和普通牛中均不存在串联重复和片段重复，种间共线性分析结果显示，水牛ACSL与普通牛ACSL存在4对片段重复基因。不同物种ACSL系统发育分析显示，ACSL基因家族具有较高的保守性，其中水牛与普通牛和牦牛的聚类更为相近。不同组织表达量分析发现ACSL1、ACSL3在乳腺组织的mRNA表达量高于其他组织，ACSL6在大脑的mRNA表达量高于其他组织，ACSL4在肺部的mRNA表达量高于其他组织，ACSL5在肝的mRNA表达量高于其他组织。根据RNA-seq 测序结果分析不同泌乳时期表达量结果显示，ACSL1在整个泌乳期均有高表达量，尤其是在泌乳第50、140和280天。ACSL3和ACSL5在泌乳第7天和第50天高表达，但随着泌乳天数增加，表达量降低。ACSL4和ACSL6在泌乳第7天表达量最高，但在整个泌乳期的表达量均远低于该家族的其他3个成员。

关键词 水牛； ACSL； 基因结构； 共线性； 系统发育；乳腺组织；表达量

中图分类号 S823.8+3  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）14-0079-07

作者简介 梁莎莎（1992—），女，广西南宁人，助理研究员，从事水牛分子遗传学研究。*通信作者，研究员，从事动物育种与繁殖研究。

收稿日期 2022-08-08

水牛以耐粗饲而著称，具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强和易饲养等特点［ 1］。除了作为役畜外，水牛还可提供奶类和肉类，具有重要的经济价值［ 2］。水牛奶乳汁浓厚，奶质优良，营养丰富，具有较高的乳脂肪（8.0%）、乳蛋白（4.5%）、不饱和脂肪酸比例和较低的磷脂和胆固醇水平［ 3］，有“奶中之王”之称。然而，水牛平均产奶量远低于荷斯坦普通牛，奶产量仅占世界牛奶产量的13%［ 4］。因此，提高水牛泌乳性能至关重要，而挖掘与产奶性状相关的候选基因有助于改善水牛泌乳性能。

长链脂酞辅酶A合成酶家族（longchain fatty Acyl-CoA synthetases，ACSLs）是哺乳动物利用脂肪酸活化催化生成酯酰辅酶A过程中所必需的酶［ 5］。目前已发现，哺乳动物ACSLs基因有5种亚型，分别为ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6［ 6-7］。研究表明，ACSLs基因在甘油三酯、磷脂和胆固醇合成及脂肪酸代谢中具有重要作用［ 8］。ACSL1基因可以提高甘油三酯中油酸的沉积，增加脂肪在细胞内的沉积量［ 5］，对牛脂肪细胞中的多不饱和脂肪酸合成具有积极调控作用［ 9］。在中国红草原牛中，脂肪细胞分化过程诱导ACSL3，其过表达可促进脂滴甘油三酯含量的增加［ 10］。ACSL4被发现的功能包括细胞内脂质储存［ 11］，胆固醇从内质网运输到线粒体［ 12］，有研究发现，ACSL4多态性与不同猪品种的IMF含量和脂肪酸组成有关［ 13］。ACSL5存在于各种组织中，包括棕色脂肪组织、骨骼肌、肝脏和大脑，有发挥促进脂肪酸在合成代谢脂类和分解代谢β-氧化通路之间的通道作用［ 14］。ACSL6最初在大鼠大脑中被发现［ 15］，ACSL6缺乏症会破坏正常的脑功能和精子发生，小鼠缺乏ACSL6会表现出运动功能障碍和星形胶质细胞增生增加［ 16］。

大量研究表明，ACSLs对哺乳动物的许多代谢过程中发挥着不可或缺的作用，特别是脂质代谢方面，然而目前关于水牛ACSL基因家族的研究较少。笔者以水牛基因组为参考，从全基因组水平鉴定水牛的ACSL家族成员，分析该家族成员的蛋白序列特征、motif分布、外显子-内含子结构、染色体定位、共线性关系、系统进化关系，运用qPCR和RNA-seq技术检测水牛ACSL基因家族在不同组织和不同泌乳时期的表达量差异，以期为后续深入挖掘水牛ACSL基因家族的功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验水牛组织cDNA（心、肝、肺、肾、胃、乳腺和大脑）均来自广西水牛研究所，品种为尼里水牛，月龄约48个月，体重约500 kg，雌性，泌乳期3头。

1.2 主要试剂和仪器设备 主要试剂  PerfectStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金公司。主要仪器  NanoDrop2000紫外分光光度计（Gene，USA）和Roche Lightcycler 480实时荧光定量PCR仪。

1.3 试验数据 以水牛及其相关物种的全基因组序列为基础进行分析。全基因组数据包括全基因组的基因序列、蛋白质序列和基因注释文件。全基因组数据源自NCBI基因组数据库（表1）。

1.4 水牛ACSL基因家族成员蛋白序列的获得

登陆UniProt（https：∥www.uniprot.org/）搜索ACSL基因家族的蛋白质序列，勾选所有该家族不同物种的可靠蛋白序列，下载保存并使用MEGA 7.0软件比对其同源性。登陆NCBI下载水牛完整蛋白序列，再使用hmmbuild和hmmsearch软件构建HMM模型，并搜索序列库找到水牛ACSL基因家族所有的蛋白序列，最后使用TBtools软件将序列提取出来。

1.5 水牛ACSLs蛋白序列特征分析

使用ProtScale（https：∥web.expasy.org/protscale/）计算水牛ACSL家族蛋白质分子量和等电点；使用TBtools软件中的Table Row Extract or Filter插件从水牛和普通牛的基因注释文件中提取ACSLs染色体分布信息。

1.6 水牛ACSLs蛋白质保守基序分析及基因结构预测

使用MEME（http：∥memesuite.org/tools/meme）和GSDS（http：∥gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析水牛ACSL家族蛋白质保守基序（motif）和基因结构；使用Pfam（http：∥pfam.xfam.org/）搜索每个motif所属的结构域；使用MEGA 7.0构建水牛ACSL家族系统进化树；最后使用TBtools软件将水牛ACSLs系统进化树和motif分析结果整合到一起进行可视化。

1.7 水牛和普通牛ACSLs共线性分析

为了探讨ACSL基因家族的进化进展，使用TBtools软件中的one step MCscanX插件对水牛和普通牛的种内及种间进行共线性分析，使用Advanced Circos和Dual Systeny Plot插件绘制物种内及种间共线性图。

1.8 不同物种ACSLs系统发育分析

为揭示水牛与其近缘物种ACSLs之间的进化关系，使用MEGA 7.0构建水牛、普通牛、牦牛、山羊、绵羊、马和骆驼的ACSL家族系统进化树，最后使用Adobe Illustrator CS6对系统进化树进行美化。

1.9 水牛ACSLs表达分析

1.9.1 不同组织表达量检测及分析。

使用Primer 3.0设计水牛ACSL基因家族qPCR引物，引物序列见表2。将水牛组织（心、肝、肺、肾、胃、乳腺和大脑）的cDNA 稀释至70～80 ng/μL，使用实时荧光定量PCR检测ACSL基因家族在不同组织中的表达情况，以GAPDH作为内参。反应体系为20 μL，其中2 x PerfectStart Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Rnase water 8.2 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL；反应条件：94 ℃ 预变性30 s，94 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40个循环。运用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，采用Duncan’s新复极差法对不同组织表达量进行多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

1.9.2 基于RNA-seq进行不同泌乳时期表达分析。

为揭示ACSLs不同成员在水牛乳腺组织中不同泌乳时期的表达量差异，笔者选用4个泌乳时期：泌乳第7天（7 d）、第50天（50 d）、第140天（140 d）和第280天（280 d），每个时期2头，活体采集共8头摩拉水牛乳腺组织进行转录组测序，测序结果已上传到NCBI数据库，登录号：PRJNA480718（SRR7523532～SRR7523538）。

ACSLs表达量分析：使用sratoolkit将所有RNA-seq原始sra文件转换为fastq格式。运用kallisto构建水牛ACSL基因家族index库，并分别比对8个RNA-seq结果，进行量化分析，计算ACSLs在不同RNA-seq中的TPM（Transcripts Per Million）值，由TPM值来表示基因的表达量，计算每组的平均值后，使用TBtools软件中的Heatmap插件对其进行可视化，绘制表达量热图。

2 结果与分析

2.1 水牛ACSL蛋白序列的获得及特征分析

对水牛基因组的蛋白序列进行搜索，共鉴定得到5条水牛ACSL蛋白的编码基因，命名为bbu.ACSL1、bbu.ACSL3、bbu.ACSL4、bbu.ACSL5和bbu.ACSL6。染色体分布情况结果显示，bbu.ACSL1位于1号染色体，bbu.ACSL3位于2号染色体，bbu.ACSL4位于25号染色体，bbu.ACSL5位于23号染色体，bbu.ACSL6位于9号染色体。bbu.ACSL6的氨基酸数为722 aa，最短的是bbu.ACSL1，为699 aa。所有蛋白的等电点除了bbu.ACSL6，均大于7.00（表3）。

2.2 水牛ACSLs motif分析和基因结构预测

根据水牛ACSLs系统进化树结果，可将水牛ACSL家族基因分为3组，即ACSL1和ACSL6为一组，ACSL5单独为一组，ACSL3和ACSL4为一组。

蛋白保守基序结果显示，共预测出10个保守的motifs（命名为Motif 1～10）。这10个保守motifs的分布见图1，氨基酸序列信息见表4。由图1可知，水牛ACSL家族成员中，除了ACSL3和ACSL4外缺少motif8外，其余均含有预测出的Motif 1～10且排序相同。使用Pfam分析每个motif后发现，除了motif7和motif8外，均含有AMP-binding结构域。基因结构结果显示，水牛ACSL1和ACSL5基因有23个外显子，22个内含子，ACSL3有15个外显子，14个内含子，ACSL4有18个外显子，17个内含子，ACSL6有24个外显子和23个内含子。