中药渣降解菌株的筛选与鉴定

摘要 ［目的］分离筛选中药渣高效纤维素降解菌，并进行纤维素酶酶活的测定，以提高药渣附加值。［方法］将中药渣腐解物及长期堆放药渣的土壤样本放置于赫奇逊培养基中富集培养，分离纯化出以药渣为唯一碳源的菌株，将得到的菌株采用刚果红平板法进行初筛，测定菌株滤纸酶（FPA）、外切β-葡聚糖酶（CBH）、内切β-葡聚糖酶（CMC）、β-葡萄糖苷酶（CB）等酶活进行复筛，通过形态学、生理生化、16S rDNA序列分析进行菌株鉴定。［结果］筛选到1株纤维素酶产生较好的纤维素降解菌株YZ25，其FPA酶活25.073 U/mL、CMC酶活24.978 U/mL、CBH酶活58.452 U/mL、CB酶活37.202 U/mL，经鉴定菌株YZ25为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。［结论］该研究丰富了药渣类纤维素降解菌株资源库，应用前景良好，对研究开发中药渣功能性生物有机肥料具有实际意义。

关键词 中药渣；纤维素降解菌株；枯草芽孢杆菌；筛选；鉴定

中图分类号 S 144 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）15-0154-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.038

Screening and Identification of Degradation Strains of Traditional Chinese Medicine Residue

ZHU Peng-ling1， WANG Lan-ying2， PENG Mei-fang2 et al

（1.Sichuan New Green Pharmaceutical Technology Development Co.， Ltd.， Pengzhou，Sichuan 611930; 2.Biotechnology and Nuclear Technology Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu，Sichuan 610061）

Abstract ［Objective］To isolate and screen the high-efficiency cellulose degrading bacteria from traditional Chinese medicine residue， and to determine the cellulase activity in order to improve the added value of traditional Chinese medicine residue. ［Method］The decomposition products of traditional Chinese medicine residues and soil samples piled up with drug residues for a long time were enriched and cultured in Hutchison medium， and the strains with drug residues as the only carbon source were isolated and purified. The obtained strains were primary screened by Congo red plate method， secondary screening by determine the strain’s filter paper activity， exo-β-glucanase activity， endo-β-glucanase activity and glucosidase activity. The strains were identified by morphology， physiology and biochemistry， 16S rDNA sequence analysis.［Result］One cellulose degrading strain YZ25 with good cellulase production was screened， with FPA enzyme activity of 25.073 U/mL， CMC enzyme activity of 24.978 U/mL， CBH enzyme activity of 58.452 U/mL， and CB enzyme activity of 37.202 U/mL. The strain YZ25 was identified as Bacillus subtilis.［Conclusion］ This study enriches the resource pool of cellulose degrading strains from drug residues and has a good application prospect， which has practical significance for the research and development of functional biological organic fertilizer from traditional Chinese medicine residue.

Key words Traditional Chinese medicine residue;Cellulose degrading strain;Bacillus subtilis;Screening;Identification

中医药是中华民族的瑰宝，随着国家多项促进中医药产业快速发展举措推进，中医对“未病先防、既病防变、病后防复”等理念的推广，及人们对健康保健重视程度的提升，中药材市场规模增长迅速。中药渣的排放量不容忽视，据统计，每年产生的药渣固体废物约有3 500万t［1］。中药渣大部分为植物类，含有粗纤维、粗脂肪、淀粉、多糖、蛋白质、氨基酸、氮、磷、钾等成分［2］，大部分中药渣都采用堆放、焚烧、填埋等传统方法处理，导致严重的资源浪费和环境污染。同时，中药渣富含纤维素、木质素类物质，阻碍了中药渣的再利用。目前针对药渣微生物降解菌株研究较少，曾飞等［3］对甘草药渣降解菌进行了筛选，选育到草酸青霉 G2，其滤纸酶活力3.43 U/mL、内切酶活力16.89 U/mL；吴清华等［4］对虎杖药渣纤维素降解菌进行筛选，初筛得到活性差异较大的纤维素降解菌7种。李婉云等［5］在药用植物根区使用羧甲基纤维素钠培养基初筛及玉米秸秆、甘草药渣固态培养基复筛，筛选到2株滤纸纤维素酶木霉菌菌株。郭建军等［6］对药渣纤维素降解菌进行了筛选，得到菌株在以药渣为底物发酵时的纤维素酶内切酶酶活最高为93.32 U/mL，外切酶酶活最高为18.77 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活最高为5.71 U/mL。由于中药材常用品种有441味，其药渣成分复杂，菌株应用效果不稳定，还需要针对不同的品种进行微生物降解菌株筛选。中药材大部分为植物类，该类中药材又分为根茎类、全草类、叶类、皮类、花类、果实类。该研究针对党参、川芎、泽泻、白芍、大黄、使君子、贯众等具有代表性的中药材根茎类中药渣品种，进行中药渣降解菌的筛选，考察菌株对该类药渣的发酵效率，以期将所筛选的菌株应用到根茎类中药渣处理中，解决大量中药渣资源化问题。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品。中药渣腐解物及长期堆放药渣的土壤样本来源于四川新绿色药业科技发展有限公司，保存于4 ℃冰箱备用。

1.1.2 培养基。赫奇逊培养基：K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.1 g，FeCl3 0.01 g，NaNO3 2.5 g，水1 L，pH 7.0。纤维素刚果红培养基：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4 ·7H2O 0.5 g，（NH4）2SO4 2.0 g，刚果红0.2 g，NaCl 0.5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0。LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂15.0 g，水1 000 mL，pH 7.0，1×105 Pa灭菌30 min。PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂15.0 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株富集、分离。分别称取药渣或土壤样品10 g，加入90 mL添加15 g新鲜药渣的赫奇逊液体培养基中，30 ℃ 150 r/min振荡富集培养7 d。取1 mL培养液进行梯度稀释，涂布于添加15 g CMC-Na的赫奇逊固体培养基上，30 ℃ 倒置连续观察培养1～7 d，每天连续观察，选取不同形态的菌落分别在LB培养基和PDA培养基上进行划线分离纯化培养。

1.2.2 菌株初筛。将分离纯化后的菌株，采用点种法接种到纤维素刚果红固体培养基上，观察平板上有无透明圈，挑取透明圈较大的菌株，测定透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d），根据比值大小初步判定纤维素降解能力的大小，并将筛选到的菌株接种到对应的斜面培养基上，30 ℃培养1～5 d，保存备用。

1.2.3 菌株复筛。

将初筛得到的菌株分别接入添加15 g新鲜药渣的赫奇逊液体培养基中，30 ℃振荡培养1～7 d，发酵液于4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液为粗酶液。

酶活测定：①滤纸酶（FPA）酶活的测定［7］。在试管（含空白）中加入1.5 mL 0.05 mol/L pH 4.5的柠檬酸缓冲液及滤纸条50 mg，置于50 ℃水浴中预热5 min，加入0.5 mL稀释酶液（空白不加），50 ℃水浴保温1 h后取出，立即向各管加入1.5 mL DNS试剂，并在空白中加入稀释酶液0.5 mL，摇匀后将全部试管同时放入沸水中加热10 min后取出，迅速冷却至室温，定容至10 mL，520 nm波长下测OD值。②外切β-葡聚糖酶（CBH）酶活的测定［8］。在试管中加入1.5 mL 0.05 mol/L pH 5.0的柠檬酸缓冲液及脱脂棉0.1 g，置于45 ℃水浴中预热5 min，加入0.5 mL稀释酶液，45 ℃水浴保温24 h后取出，显色过程及对照同FPA酶活测定，520 nm波长下测OD值。③内切β-葡聚糖酶（CMC）酶活测定［8］。在试管中加入1.5 mL 1％CMC柠檬酸缓冲液，预热5 min后，加入0.5 mL稀释酶液，45 ℃水浴保温30 min后取出，显色过程及对照同FPA酶活测定，520 nm波长下测OD值。④β-葡萄糖苷酶（CB）酶活的测定［9］。在试管中加入1.5 mL 0.5％水杨苷柠檬酸缓冲液，预热5 min后，加入0.5 mL稀释好的酶液，50 ℃水浴保温30 min后取出，显色过程及对照同FPA酶活测定，520 nm波长下测OD值。

1.2.4 菌株鉴定。

形态鉴定和生理生化特性研究参考文献［10］。使用基因DNA提取试剂盒（Thermo Fisher）进行DNA提取，采用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对菌株进行16S扩增。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃45 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min。产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI进行Blast比对同源系列，使用MEGA软件，构建系统发育树，结合菌株形态学、生理生化特征确定菌株名称。