河南新野产紫甘蓝花青素的提取工艺和调节双卵巢切除模型(OVX)小鼠糖耐量的研究

摘要 ［目的］探讨新野产紫甘蓝中花青素提取的最适条件，并揭示其对更年期模型动物糖耐量的调节作用。［方法］利用紫外-可见分光光度计和Greey公式直接计算提取液中花青素光密度和含量，探讨乙醇浓度、温度、提取时间和料液比等单因素对花青素提取的作用，并利用正交试验获得最佳提取条件；利用双卵巢切除模型小鼠（OVX）和腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）研究紫甘蓝花青素对模型小鼠糖耐量的改善作用，利用定量PCR探讨相关机理。［结果］单因素试验发现，在酸化乙醇的条件下，乙醇浓度为40%、温度为55 ℃、提取时间为4 h、料液比为1∶15（g∶mL）时提取效果最好；正交试验表明，提取温度70 ℃、乙醇浓度60%、提取时间4 h、料液比1∶20为最佳提取条件，在此条件下，1 kg紫甘蓝中可得到花青素148.8 mg。花青素灌胃［100 mg/（kg·d），0.5 mL］处理OVX小鼠70 d后，相较假手术对照组，OVX手术导致小鼠糖耐量显著降低，曲线下面积（AUC）增加37.2%（P<0.05）；普通甘蓝对糖耐受的调节并不显著，紫甘蓝花青素则可使OVX动物糖耐量的AUC降低30.5%，与假手术组的基本相当。定量PCR研究发现，相对假手术组（Shm+H2O），OVX手术（OVX+H2O）小鼠肝脏葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）的表达水平升高了（5.22±1.02）倍，OVX+花青素组（OVX+BOR）和OVX+0.02 mg/（kg·d）补佳乐（OVX+E2）的表达量分别升高了（2.40±0.34）和（1.82±0.18）倍，与OVX+H2O和OVX+BO组相比，OVX+E2组、OVX+BOR组均显著降低了肝脏中G6Pase水平。［结论］紫甘蓝是天然花青素的重要来源，其可通过降低OVX小鼠肝脏中G6Pase的表达改善糖耐量，对缓解更年期高血糖等代谢综合征有一定的价值。

关键词 紫甘蓝；花青素；提取工艺；糖耐量；双卵巢切除模型

中图分类号 R 28  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）16-0156-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.16.038

Study on the Extraction Process of Anthocyanins from Brassica oleracea var．capitata rubra Cultivated in Xinye，Henan and Its Regulatory Effect on Glucose Tolerance in Ovariectomized （OVX） Mice

ZHOU Zi-liang1，ZHANG Yi-jing2，HE Ye2 et al

（1.Agricultural Technology Application Center，Xichuan，Henan 474450;2.Zhang Zhongjing College of Chinese Medicine，Nanyang，Henan 473004）

Abstract ［Objective］To explore the optimal conditions for the extraction of anthocyanidin from Brassica oleracea var．capitata rubra and reveal its regulation on the glucose tolerance of climacteric model animals.［Method］The optical density and content of anthocyanidin in the extraction solution were directly calculated by using the ultraviolet visible spectrophotometer and the Greey formula，and the effects of ethanol concentration，temperature，extraction time and solid-liquid ratio on the extraction of anthocyanidin were discussed，and the optimal extraction conditions were obtained by orthogonal test.The improvement effect of anthocyanidin from Brassica oleracea var．capitata rubra on glucose tolerance in ovariectomized mice （OVX） and intraperitoneal glucose tolerance test （IPGTT） was studied，and the related mechanism was explored by quantitative PCR.［Result］The single factor experiment found that under the conditions of acidified ethanol，the extraction effect was best when the ethanol concentration was 40%，the temperature was 55 ℃，the extraction time was 4 hours，and the solid-liquid ratio was 1∶15 （g∶mL）.Orthogonal test showed that the optimum extraction conditions were extraction temperature of 70 ℃，ethanol concentration of 60%，extraction time of 4 h，solid-liquid ratio of 1∶20.Under these conditions，148.8 mg anthocyanidin could be obtained from 1 kg Brassica oleracea var．capitata rubra.After the OVX mice were treated with anthocyanidin ［100 mg/（kg·d），0.5 mL］by gavage for 70 days，compared with the Sham surgery control group，the glucose tolerance of the mice was significantly reduced and the area under the curve （AUC） was increased by 37.2% （P<0.05）;the regulation of sugar tolerance of ordinary cabbage was not significant，while anthocyanidin from Brassica oleracea var．capitata rubra could reduce the AUC of sugar tolerance of OVX animals by 30.5%，basically equivalent to that of the Sham surgery group.The quantitative PCR study found that compared with the Sham surgery group （Shm+H2O），the expression level of glucose-6-phosphatase （G6Pase） in the liver of OVX operated （OVX+H2O） mice increased by （5.22±1.02） times，and the expression level of OVX+anthocyanidin group （OVX+BOR） and OVX+0.02 mg/（kg·d） of paclitaxel （OVX+E2） increased by （2.40±0.34） and （1.82±0.18） times，respectively，compared with the OVX+H2O and OVX+BO groups，the OVX+E2 and OVX+BOR groups significantly reduced G6Pase levels in the liver.［Conclusion］Brassica oleracea var．capitata rubra is an important source of natural anthocyanidin，which can improve glucose tolerance by reducing the expression of G6Pase in the liver of OVX mice，and has certain value in alleviating the metabolic syndrome such as menopausal hyperglycemia.

Key words Brassica oleracea var.capitata rubra;Anthocyanins;Extract process;Glucose tolerance;Ovariectomized mice

基金项目 河南省自然科学基金项目（212300410376）；南阳理工学院大学生科研基金项目（NG2019DKJ-070）。

作者简介 周自亮（1965—），男，河南淅川人，高级农艺师，从事农作物和中药栽培及农业经济研究。通信作者，教授，博士，从事药用植物学和分子内分泌学研究。

收稿日期 2022-09-03；修回日期 2022-10-21

花青素是植物体内的水溶性色素，由黄酮类前体经过苯丙素途径衍生而成。花青素主要存在于植物细胞的液泡中，因对pH、光线、温度和金属离子等敏感而呈现红色、紫色或黑色等不同颜色［1-3］，是植物体多彩的重要原因之一。花青素多见于植物的花器官，如杭白菊（Chrysanthemum morifolium）［4］ 和蝶豆（Clitoria ternatea）［5-6］的花瓣，或果实或果皮中，如越桔（Vaccinium section Cyanococcus）［7］、蓝莓（Vaccinium Angustifolium）［8］、葡萄（Vitis vinifera）［9］和南阳绿米（Oryza sativa L.Nanyangensis）的稻壳中［10］，也可存在于植物的营养器官中，如紫薯（Dioscorea alata）［11］、甜菜根（Beta vulgaris）［9］和紫甘蓝（Brassica oleracea var.capitata rubra）［12］等，这些植物的组织和器官形成了花青素的自然资源。

花青素被认识有超过100年的历史，但真正深入认识是1990年后，尤其在2015年后，相关研究为花青素用于人类慢性病的预防和治疗取得了较大的进展［13］。花青素是黄酮类化合物中反应力较强的一类，其抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍［14］。同时，具有抗炎症、抗过敏、改善肠道菌群等综合效果［2，8，13，15- 16］，饮食中含花青素的水果或蔬菜可降低餐后血糖水平，提高降血糖反应时间［17］，直接服用花青素可减少心血管疾病和 Ⅱ 型糖尿病等代谢性疾病的发病概率［18］，防止肥胖［15］，对高糖诱导的高胆固醇和炎症［15，19］、心血管疾病［15-16，20］ 、关节炎［21］等慢性疾病有防治效果；也可延迟神经衰老［2，8］和抗抑郁［22］，对退行性疾病和精神病具有明显的改善作用。花青素还可以改善卵巢切除小鼠模型的血液胆固醇水平［23］。花青素也作为化妆品［24-25］、食品［3，26］、饲料［27-28］、酒和普通饮品的添加剂［29］，是提高食品品质的重要手段。由于花青素的颜色随酸碱度变化而呈现不同的颜色，因此也作为显示酸碱度变化（即新鲜度）的牛奶、肉类和鱼制品的食物智能包装膜［30］。另外，分子模型的模拟研究表明，花青素还可能通过结合血管紧张素转化酶2（ACE2）抑制新冠病毒进入宿主细胞，并抑制炎症因子如肿瘤坏死因子（TNFα）、白细胞介素6（IL6）的升高，提高抗炎症因子如白细胞介素10（IL10）的水平，从而减轻新冠病毒感染后的症状［5］。鉴于对花青素认识的深入和食物、药物及化妆品市场的不断扩大，花青素的需求量持续稳步提高，根据2021年最新出版的国际花青素市场（Anthocyanins Market）年度报告预估，2022—2027年国际花青素市场将以平均4.5%的速度增长，其中，亚太地区的增长率最为强势。因此，寻求高质量、相对低成本和供给稳定的花青素资源将是一项亟待解决的工作。

紫甘蓝（B.oleracea var.capitata rubra）属十字花科植物，又称紫苞菜，起源于欧洲［16］，因其花青素合成过程中的抑制基因BoMYBL2-1表达缺失而导致叶表皮细胞富含花青素而显示红紫色［31］。变异后的紫甘蓝也被称为“西土蓝”，可用于治感冒、发烧口渴、支气管炎、咳嗽、食积、便秘、小便不利等疾病。紫甘蓝因富含花青素而具有抗氧化、抗微生物感染、抗癌［12］和缓解 Ⅱ 型糖尿病［18］等功能，是典型的功能食品。紫甘蓝现在世界各地都有种植，近年来在河南新野县也大量种植，完善的栽培工艺已经可以达到四季均可产出，产量可达75 000 kg/hm2，具有易种、易采、产量大的特点。因此，紫甘蓝的高产量是其他蔬菜和水果不具备的，紫甘蓝花青素具有价廉和资源稳定等优点，也因此引起了广泛的关注［16］。

目前对紫甘蓝花青素提取工艺的研究主要集中于单个因素如温度、溶剂浓度、提取时间或温度等以及提取手段如溶剂类型、超声波和临界冷冻萃取等对提取量和产品稳定性的影响［8］。但对单个因素的系统研究和多因子综合作用的效果鲜见报道。该研究利用不同波长下光密度差异法和Greey公式测定新野产紫甘蓝中花青素的含量，研究温度、料液比、提取时间、乙醇浓度等单个因素对紫甘蓝花青素提取量的影响，在此基础上设计了正交试验，得到最佳提取条件和相应的花青素提取量；同时，采用手术摘除小鼠双侧卵巢（OVX）诱导糖耐量降低的动物模型，研究紫甘蓝花青素对更年期动物模型糖耐量的调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。紫甘蓝采自南阳新野县种植的新鲜紫甘蓝，收集的时间为2020年和2021年3—6月。动物实验所用的雌性昆明小鼠购自河南省动物实验中心，鼠龄8周，体重（23±2）g。动物饲养过程中光照模仿12 h∶12 h昼夜模式（06：00—18：00），恒温（22.0±0.5）℃，相对湿度约40%。试验操作和动物饲养规范按照南阳理工学院相关文件（NITAEE17-0014）要求和动物学会相关要求进行［32］。