猪粪堆肥复合菌剂培养条件优化及其对好氧堆肥的影响

摘要 探究3种菌组合成的复合菌剂对猪粪的降解性能以及堆肥产品质量的作用。采用单因素试验确定复合菌剂培养条件的最优范围，建立猪粪好氧堆肥体系，测定不同堆肥时期的各项指标。试验结果表明：复合菌剂最适培养条件为酵母粉3.9 g，尿素3.9 g，葡萄糖4.5 g，淀粉0.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5，添加量8%。添加复合菌剂堆体比自然堆体提前10 d完成堆肥，升温速度更快，高温期持续时间更长，纤维素降解率为64.79%，淀粉降解率为73.89%，油脂降解率为56.42%。3株降解菌组合而成的复合菌剂对于纤维素、淀粉和油脂具有良好的降解效果，均优于自然堆肥，作用于堆肥效果良好，在猪粪堆肥无害化处理及资源化利用方面具有一定应用价值。

关键词 猪粪；堆肥；复合菌剂；响应面；应用

中图分类号 S141.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）17-0051-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.17.012

Response Surface Optimization of Pig Manure Compost Compound Microbial Agent and Its Effect on Aerobic Composting

WANG Cong1，2， JI Hong-liu1， YIN Miao1，2 et al

（1. Mianyang Normal University Animal Disease Prevention and Control and Healthy Breeding Engineering Technology Research Center， Mianyang， Sichuan 621000;2. Sichuan Research Center for Monitoring and Control of Major Pig Diseases， Mianyang， Sichuan 621000）

Abstract To explore the effect of the compound bacterial agent composed of three kinds of bacteria on degradation performance of pig manure and quality of compost products. The single factor test was used to determine the optimal range of the culture conditions of the compound bacterial agent， establish the aerobic composting system of pig manure， and determine the indexes of different composting periods. The results showed that the optimum culture conditions of compound bacterial agent were yeast powder 3.9 g， urea 3.9 g， glucose 4.5 g， starch 0.5 g， K2HPO4 1.0 g， NaCl 5.0 g， distilled water 1 000 mL， pH 7.5， adding 8%. The composting was completed 10 days earlier than the natural composting， the heating rate was faster， the high temperature period lasted longer， and the cellulose degradation rate was 64.79%， the starch degradation rate was 73.89%， and the oil degradation rate was 56.42%. The compound bacterial agent composed of three degrading bacteria has good degradation effect on cellulose， starch and oil， which is better than natural compost， and has a good effect on compost. It has a certain practical effect on harmless treatment and resource utilization of pig manure compost.

Key words Pig manure;Composting;Compound bacterial agent;Surface of response;Application

随着生活质量的提高，畜禽养殖业在我国得到了快速发展，畜牧经济增长迅速［1］。然而，随着畜禽养殖规模化程度的不断提高，畜禽粪尿排泄物集中产生、乱堆乱放，使得畜禽养殖带来的环境污染问题日益严重［2-3］。据统计，我国每年畜禽粪污产生量高达38亿t，但综合利用率却不足60%［4］。然而，畜禽中含有丰富的有机质和营养元素，可以进行堆肥处理，使其成为可用资源［5］。随着现代生物技术的快速发展及高效化应用，添加微生物菌剂已成为堆肥发酵中的常用手段［6］。

添加微生物菌剂可调节堆体微生物群落结构，缩短发酵时间［7］，迅速有效分解纤维素等有机物质［8］，提高堆肥产品的肥效［9-11］，减少恶臭气体的排放［12］，对改善生态环境、实现资源循环利用具有重要意义［13］。

响应面优化分析法作为一种试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用的回归分析，则常用于菌剂的条件优化［14］，进而使复合菌剂的活菌数达到最优，为复合菌剂的扩大培养和开发提供技术支持。笔者将复合菌剂应用于实际猪粪好氧堆肥过程，探究自制复合菌剂的可行性，以期为生物发酵堆肥应用研究提供理论基础与参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜猪粪收集于四川铁骑力士养殖场；玉米芯由绵阳师范学院人工气候室提供；堆肥样品来自四川铁骑力士公司；凋落物来自学校凋落物、野外凋落物；厨余垃圾周围土壤取自学校食堂垃圾堆周边。堆肥原料基本信息见表1。

纤维素降解菌筛选培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）2.00 g，NaCl 5.00 g，K2HPO4 1.00 g， MgSO4·3H2O 0.50 g，NaNO3 3.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20.00 g，去离子水1 000 mL。淀粉降解菌筛选培养基：蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、琼脂粉15.00 g，水1 000 mL，pH 7.0。

油脂降解菌筛选培养基：蛋白胨10.00 g，酵母膏5.00 g，罗丹明B 0.01 g，NaCl 10.00 g，MgSO4·7H2O 1.00 g，K2HPO4 0.50 g，KH2PO4 0.50 g，琼脂粉15.00 g，菜籽油12.00 mL，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

纤维素降解菌产酶培养基：CMC-Na 10.00 g，蛋白胨2.00 g，酵母提取物2.00 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH。

淀粉降解菌产酶培养基：蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、琼脂粉15.00 g，水1 000 mL，pH 7.0。

油脂降解菌产酶培养基：蛋白胨10.00 g，酵母膏5.00 g，罗丹明B 0.01 g，NaCl 10.00 g，MgSO4·7H2O 1.00 g，K2HPO4 0.50 g，KH2PO4 0.50 g，菜籽油12 mL，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

种子培养基：葡萄糖5.00 g，酵母粉5.00 g，K2HPO4 1.00 g，NaCl 5.00 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌种的筛选。

从新鲜猪粪、堆肥样品、凋落物、厨余垃圾周围土壤中筛选菌种，接种于纤维素、淀粉、油脂培养基上，分别选出对纤维素、淀粉、油脂降解率高的菌种，将其分别命名为XWS、DF、YZ。对各菌株进行拮抗试验，选择相互无拮抗作用的菌株用于堆肥复合菌剂的制备。

1.2.2 复合菌剂单因素条件优化。

进行单因素试验［15］前，为了确保试验的准确性，对初始菌液浓度进行统一。在灭菌后的LB培养液中接入由1∶1∶1复合而成的微生物菌液，在37 ℃ 180 r/min条件下培养18 h。在OD600调零的分光光度计下，以未接种菌液的LB培养液作为对照，在空比色皿中加入不同体积的混合菌液和LB培养液，直至OD值为1.0后依据这个比值，在新的已灭菌的锥形瓶中进行混合，并重新测定锥形瓶中混合液的OD600，再次根据重新测定的OD600微调至OD值为1.0为止。之后每次相关试验所需初始菌液浓度均为以上测得数值。然后考虑不同碳源、氮源组合及其添加量，改变不同初始pH、温度、菌液添加量、不同转速，探究每个因素的最优条件，以培养出最优菌剂。

1.2.3 复合菌剂Plackett-Burman试验设计。

根据单因素试验得出每个因素的最适范围，将每个因素的高低2水平输入Plackett-Burman试验设计［16］，对试验的高低水平进行编码，然后生成相应的试验设计表格，将试验数据再次填入试验设计表格进行分析，从而得到对试验影响显著的因素。

1.2.4 复合菌剂Box-Behnken试验设计。

根据Plackett-Burman试验设计结果对复合菌剂进行Box-Behnken试验设计［17］，然后通过生成的试验表格进行试验，进而对试验结果进行数据分析，随后获得相应的回归方程，最后通过该方程得到最佳的活菌数生长条件。

1.2.5 堆肥体系构建与取样、指标测定。

将玉米芯与猪粪充分混合，置于泡沫箱中。对照空白组：猪粪+玉米芯，不添加任何外源菌剂；处理组：猪粪+玉米芯，添加自制外源菌剂。

为确保堆肥的成功率，以温度变化为依据进行适当的翻堆处理。温度每天记录，每进入一个堆肥阶段进行一次样品采集，每次采样取上、下、左、右、中5个方位，及对应位置的上、中、下3层进行采样，采样四分法分取样品，共采集300 g左右即可。将采集的样品分成2部分，一部分经研磨后过100目尼龙筛，用于后续各项指标的检测试验，另一部分保存。

堆体的总碳、总氮及pH根据《肥料合理使用准则有机肥料》进行测定；含水率以及蚊、蝇密度气味等感官评价参考GB 7959—2012标准测定；种子发芽率计算按NY/T 3442—2019的规定执行；采用失重法测定纤维素降解率，采用分光光度法测定淀粉降解率，采用分光光度法测定油脂降解率［18］。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

2.1.1 初筛。

从新鲜猪粪等材料中筛得纤维素降解菌22株，淀粉降解菌18株，油脂降解菌23株，共63株。

2.1.2 复筛。

由于堆肥过程中升温，对菌株的筛选需考虑升温后的酶活性、降解性能。对比37 ℃与55 ℃下各种菌的性能，22株纤维素降解菌在37 ℃均有降解效果，但温度升到55 ℃后仅有如图1a所示的6株，XWS-3、XWS-8、XWS-9、XWS-12、XWS-19酶活大大降低，波动幅度过大，产酶性状不稳定。菌株XWS-22产酶性能较37 ℃时稍下降，其波动在可接受范围内，因此，选择菌株XWS-22作为复合菌剂的目标菌株。