小麦TaTVP1基因的克隆与表达分析

摘要 ［目的］发掘并研究小麦TaTVP1基因响应耐盐、耐旱等非生物胁迫的功能与机制，为小麦抗逆育种提供新的基因资源。［方法］利用PCR技术克隆小麦TVP1基因，扩增获得cDNA全长序列，并对其进行生物信息学分析，进一步利用qRT-PCR技术分析其表达模式。［结果］小麦TVP1基因全长2 289 bp，编码762个氨基酸；其氨基酸序列具有12个跨膜结构，该结构中疏水氨基酸具有高度保守性，且肽链N末端与C末端均位于膜外，预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D结构蛋白，推测与其具有的H+离子泵通道功能密切相关；系统发育树分析表明，TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高，该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群 Ⅰ和 Ⅱ；定量PCR分析表明，小麦中TVP1基因在根、茎中的表达量要明显高于叶、穗中，具有组织特异性，且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异，这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关。［结论］克隆并分析了小麦TaTVP1基因，为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础。

关键词 小麦；TVP1基因；生物信息分析；表达模式分析

中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）17-0087-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.17.019

Cloning and Expression Analysis of TaTVP1 Gene in Wheat

MA Yan-bin，  LI Huan-li， WEN Jin et al

（Shanxi Agriculture University/Institute of Cotton Research，Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Yuncheng， Shanxi 044000）

Abstract ［Objective］To explore and investigate the functions and mechanism of TaTVP1 genes in wheat in response to abiotic stresses such as salt， drought tolerance，and provide a new genetic resources for wheat stress resistance breeding.［Method］In this study， we cloned the wheat TVP1 gene by PCR，amplified the full-length cDNA sequence， and performed the bioinformatic analysis， and further analyzed the expression pattern by qRT-PCR.［Result］TVP1 gene in wheat is 2 289 bp and encodes 762 amino acids which containing 12 transmembrane structures，in these structures， hydrophobic amino acids are highly conserved， and both the peptide chain N and C terminal are located outside the membrane，it is predicted that the transmembrane structure could form a high-level 3D structure protein with obvious pore， which may be closely related to its H + pump channel function;phylogenetic tree analysis indicates high homology of TaTVP1 to monocot TVP1 proteins， and two distinct groups I and II could be classified between monocotyledons and dicotyledons during the evolution of the type of TVP1 genes;quantitative PCR analysis showed that the expression of TVP1 gene in roots and stems was significantly higher than that in leaves and ears， with tissue specificity， and the expression trend of this gene in the same tissue was also different between different materials，this may be related to the difference in drought resistance and other stress resistance among different materials.［Conclusion］In this study， the TaTVP1 gene was cloned and analyzed， which laid a foundation for further clarifying the mechanism of this gene involved in protection against abiotic stresses.

Key words Triticum aestivum;TVP1 gene;Bioinformatic analysis;Expression pattern analysis

土壤盐碱化等非生物胁迫是导致小麦等农作物减产的主要因素之一，土壤中过高的钠离子浓度会破坏胞内的离子平衡，造成作物体内的代谢途径紊乱，从而抑制其生长。为降低盐碱逆境对农作物产量的影响，除改良土壤外，培育耐盐碱农作物品种也可有效抵御土壤盐碱化等不利影响，进而在一定程度上稳定农作物产量。多年来，传统遗传育种与分子改良相结合极大地促进了研究人员选育具有耐盐碱、耐旱等特性种质资源的效率［1-2］。

近年来，作物中多种耐旱、耐盐碱的基因被克隆鉴定并证实有助于改良作物的耐逆特性。H+转运无机焦磷酸酶（H+-PPase，TVP）是一种广泛存在于生物体内的H+转运酶，可作为调解细胞酸度的质子泵，驱动各种离子在液泡内的区隔化，同时也参与了调解植物生长素的运输，在植物环境耐受性、生长发育过程中都可能起到了作用［3］。有报道称，大豆GmVP1基因能提高转基因大豆发状根在一定条件下对盐胁迫的反应［4］；TPSP融合基因在小麦中的表达可表现出较强的耐旱性［5］；烟草中敲除NtMYB68转录因子能改善烟叶中紫黄质的堆积，促进脱落酸的合成，从而改善烟株的抗旱性［6］；拟南芥中过表达白菜Bp-NFYA5、番茄sly-miR397基因可以提高其干旱耐受性［7-8］；外源基因玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的过表达，可使玉米耐旱性增强［9］；GhPNP1 可通过cGMP 信号途径正向调解棉花对干旱的耐受性［10］；大豆中的BADH 基因也表现出较强的抗旱性［11］；此外，植物耐旱密切相关的还有DREB类等基因［12-13］；细胞质膜蛋白SOS1和液泡膜蛋白NHX协同作用，使胞质内维持低浓度盐离子，从而提高了植物的抗盐性［14-16］。综上所述，各类不同基因的研究极大地丰富了耐旱、盐碱基因研究的理论基础，同时也说明作物耐旱、盐碱机理可能具有更复杂的多途径调控网络。因此，还需对植物的耐盐、耐旱性进一步探索，从更多的抗逆性作物着手，挖掘更多相关基因，从细胞、组织和整体水平上阐释植物耐干旱、盐胁迫的信号调控机制，进而为作物的遗传改良奠定基础。现有的研究已有很多关注小麦抗逆材料的创制及其分子机制的解析，笔者以小麦耐旱品种晋麦47和舜麦1718为材料，对其TVP1基因进行克隆鉴定，并利用生物信息学对该蛋白进行理化性质、跨膜结构、保守结构域和发育进化等方面进行分析，旨在为进一步研究该基因的功能与机理打下基础，同时也为利用该类基因进行植物耐逆优良种质选育提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试材料晋麦47（JM47）、舜麦1718（SM1718）均为山西省农业科学院棉花研究所国审品种，种植于山西省农业科学院棉花研究所试验田。

1.2 材料处理

将晋麦47（JM47）、舜麦1718（SM1718）2种品种小麦籽粒浸泡在经过高压灭菌的蒸馏水中，过夜萌发，次日挑选生长状态一致饱满的种子，播种于土壤条件相同的花盆中，在22  ℃恒温培养箱中进行培养，长日照7 d，取苗样液氮速冻，于-80 ℃保存，供DNA提取之用。小麦在温室盆栽中生长至幼穗阶段时，取根、茎、叶、穗4个组织样品于无RNA酶离心管中，液氮速冻以备RNA提取。

1.3 总DNA提取、RNA提取和cDNA制备

DNA按照GENEOUTTM Plant DNA Isolation Kit （LABGENE， 上海）试剂盒的说明书进行提取，-20 ℃保存。小麦材料及其不同组织样品在液氮低温下冷冻磨成样品，分别称取约0.1 g样品粉末，加入Trizol试剂（Invitrogen，USA）进行RNA提取，整个试验过程严格按照操作要求进行，避免RNase污染。利用分光光度计测定各样品RNA浓度、纯度后，以RNA为模板，参考RNA反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription Mix， Oligo（dT） （Promega， 上海）说明书，合成cDNA第1链，于-20 ℃冰箱保存。

1.4 TaTVP1基因的克隆

从NCBI数据库下载TaTVP1 （AY296911.1）基因CDS序列，利用Primer Premier 6.0软件根据该基因保守序列设计克隆特异性引物，引物由北京奥科生物科技公司合成，序列分别为TaTVP1-F：5′-CATGGCGATCCTCGGG-3′，TaTVP1-R： 5′-CTAGATGTACTTGAAC-3′。以晋麦47和舜麦1718幼苗的cDNA分别为模板，利用Ex Taq酶（Takara，上海）扩增TaTVP1基因的全长序列。反应条件为：94 ℃预变性4  min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸2  min，终延伸10 min，30个循环。PCR产物经浓度1%琼脂糖凝胶电泳检测，按照DNA纯化回收试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）说明书回收片段，进行克隆。

1.5 蛋白结构分析

利用SOSUI软件预测分析TaTVP1蛋白的跨膜结构域；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）对TaTVP1蛋白的三维结构进行在线预测。

1.6 进化关系分析

从NCBI网站blastp分析并下载与TaTVP1氨基酸序列同源性较高的其他物种的氨基酸序列，利用Clustal工具进行多序列比对，MEGA 5.0软件分析进化关系，利用Neighbor-Joining算法构建进化树，Bootstrap分析1 000次。