C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

摘要 以经典毒株C株的基因组为模板，测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析，并对抗原表位进行预测，结果表明NS3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c，并设计相应的引物，分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因，分别用pET-28a表达载体进行重组后，获得pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c，用表达菌株BL21（DE3）进行表达，b段表达较高，可溶性表达较好，纯化后，可获得重组蛋白CSFV-His-NS3b，SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD，Western-Blot证实其具有良好的免疫原性，并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL，表明该蛋白特异性很强，可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。

关键词 NS3蛋白；表达；诊断

中图分类号 S 852.65文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）18-0115-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.18.025

Analysis of Epitope of NS3 Protein of Classical Swine Fever Virus Strain C and Detection of Its Segmented Expression Activity

DING Guo-wei，LI Tian-tian，XU Ping et al

（Yangzhou Youbang Biological Medicine Co.，Ltd.，Yangzhou，Jiangsu 225008）

Abstract Using the genome of classical virus strain C as a template，the secondary structure of NS3 protein was analyzed and the Epitope were predicted after sequencing. The results showed that NS3 had very rich secondary structure and rich B cell Epitope and T cell Epitope. Three different gene regions a，b，and c were intercepted，and corresponding primers were designed to amplify target genes of approximately 645，609，and 615 bp，respectively. After recombination with pET-28a expression vector，pET-28a-NS3a，pET-28a-NS3b，and pET-28a-NS3c were obtained.The expression strain BL21 （DE3） was used for expression，with high expression in segment b and good soluble expression. After purification，a recombinant protein CSFV-His-NS3b was obtained. The size of the recombinant protein confirmed by SDS-PAGE was about 27 kD，and Western-Blot confirmed its good immunogenicity. The protein concentration measured by ELISA was about 5 mg/ml，indicating that the protein has strong specificity and can be used for the development and application of swine fever diagnostic kits.

Key words NS3 protein; Expression; Diagnosis

猪瘟是一种由猪瘟病毒感染引起的传染病，给全球范围内的养猪行业造成了严重的经济损失［1］。猪瘟病毒主要编码12种蛋白，其中病毒增殖所必需的非结构蛋白之一就是NS3蛋白［2-3］，且该蛋白高度保守。机体感染猪瘟病毒后可检测到NS3抗体［4］。猪瘟病毒感染猪后引起发热，体温升高，出血坏死等典型症状［5］，具有非常高的发病率，混合感染引起的死亡率也很高。属于1类传染病，目前尚缺乏很好的治疗方法，一旦发病立即采取扑杀措施，是养猪业所面临的难题［6］。

NS3蛋白是由NS2-3蛋白进一步加工而成，其编码基因长达2 049 bp，具有多种酶活性，该蛋白功能比较多［7］。并且NS3的生物学特征和基因序列在不同毒株之间没有显著差异。大量研究证明，该蛋白免疫活性高，可以刺激机体使机体产生高水平的针对该蛋白的特异性抗体。由于NS3所诱导产生的抗体的保护性未得到验证，因此，虽然不适合用于制备疫苗，但是可以通过检测NS3的抗体来对猪瘟进行诊断。因此，在CSFV的检测与诊断方面，研制抗NS3蛋白的诊断试剂盒将受到关注。笔者使用原核表达系统pET-28a对NS3的基因片段进行了分割连接，然后进行表达和纯化，获得具有免疫活性的截短蛋白，为今后猪瘟病毒的鉴别诊断等提供材料。

1 材料与方法

1.1 菌株及载体 该研究使用的经典猪瘟毒株为经典C株，表达载体为pET-28a，表达菌株为BL21（DE3），均为实验室保存。

1.2 主要试剂

分子生物学试剂主要有：2×Taq Master Mix、DEPC（焦碳酸乙二酯）、T4连接酶、Trizol LS resgent（Invitrogen）、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix、HindIII、BamHI、SalI和DNA Marker、Agarose Gel DNA Extraction Kit、PCR clean up kit、IPTG、RNaseA和X-gal等。

1.3 方法

1.3.1 病毒cDNA的获得。

通过Trizol方法提取猪瘟病毒RNA，并根据北京全式金生物技术的逆转录试剂盒的说明对RNA进行逆转录，并在-20 ℃下保存备用。

1.3.2 NS3全基因测序分析。

参考GenBank中比对CSFV的NS3全基因序列，设计1对引物NS3-F、NS3 -R；将cDNA送至生物技术公司进行测序。然后用DNAStar软件中的Protean分析NS3蛋白的二级结构、亲水性、表面可及性、可塑性和抗原表位进行分析［8］。

1.3.3 引物设计与合成及目的基因的获得。

在分析CSFV C株的NS3基因及蛋白序列后，截获第1段，即a段第1～212位氨基酸、b段第189～389位氨基酸以及c段第390～591位氨基酸；并设计相应引物NS3a-F/R、NS3b-F/R和NS3c-F/R，在起始端加上BamH I酶切位点，在终止端加上Sal I酶切位点，送至生物公司进行合成，引物使用浓度为20 μmol/L，于-20 ℃冻存备用，上述引物可以分别扩增出a、b、c 3段基因片段，a段位于1～212位氨基酸，b段位于189～389位氨基酸，c段位于390～591位氨基酸，大小分别为645、609和615 bp（图1）。a、b、c 3段基因引物设计为NS3a-F：CGCGGATCCATGGGCAGGGGGCCCGCTGTTTG；NS3a-R：ACGCGTCGACTTACTTCACCATCTCCGTCAAGTCCGTG；NS3b-F：CGCGGATCCATGGGCAAACCAACCAAGCTCATG；NS3b-R：ACGC-GTCGACTTAGGCAATGTCCAAGTAATCTGAACCTAAG；NS3c-F：CGCGGATCCATGGGCGGACTGAAGATACCAGTAG；NS3c-R：ACGCGTCGACTTACATTATATTTTTTACTGCTACCGGCAAC。

1.3.4 DNA片段的纯化回收及连接转化。

将目的条带切胶后进行回收纯化，纯化后测定浓度并建立20 μL的双酶切体系，将目的基因与pET-28a用BamH I和Sal I分别于37 ℃酶切2～3 h；限制酶消化后，按照Axygen试剂盒的说明书纯化；然后建立20 μL连接体系进行4 ℃过夜连接；将连接产物转化到受体菌中，并且静置培养后，挑取阳性菌落培养并用于PCR鉴定。

1.4 重组质粒的PCR鉴定和测序

用小提质粒试剂盒提取pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c重组质粒。通过PCR鉴定上述重组质粒，并通过测序进一步验证。

1.5 重组蛋白的表达及纯化

1.5.1 蛋白的诱导表达。

将鉴定及测序正确的重组质粒pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c转化至表达菌株，用终浓度为1.0 mmol/L IPTG，37 ℃ 220 r/min摇床诱导表达4 h，同时，设置空载体对照组。通过离心收集细胞，重悬，并通过超声波裂解仪裂解5 min，并离心5 min取上清液，用于蛋白质电泳分析。

1.5.2 NS3b目的蛋白的大量表达及纯化。将10 mL母液加入800 mL 抗Kana LB液体培养基中诱导表达5h或过夜表达，离心收集菌体，对表达的重组蛋白CSFV-His-NS3b参照HisTrap HP组氨酸标记亲和层析柱说明书进行Ni柱纯化，具体方法如下：①用Ni柱上样缓冲液将菌体洗2次，100 mL 重悬，超声波裂解仪裂解10 min，悬液变得清透，蛋白可溶，离心并收集上清液；②用0.45 μm滤器将上述收集的上清进行过滤除杂；③用超纯水清洗Ni柱后，用Ni柱上样缓冲液平衡Ni柱；④上样，并收集样品备用；⑤上样完成后用Ni柱上样平衡缓冲液进行平衡，而后用含10 mmol/L咪唑除杂液进行除杂，每步留样备用；⑥最后用洗脱液洗脱Ni柱结合的蛋白，收集保存样品；⑦洗脱后用Ni柱上样缓冲液平衡Ni柱，之后以0.01 mol/L NaOH洗柱，再以 20%乙醇过柱，4 ℃保存。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒及ELISA 2种方法，测得蛋白浓度约为5 mg/mL。

1.6 免疫原的分析鉴定

1.6.1 SDS-PAGE分析鉴定。SDS-PAGE电泳前蛋白预处理：取40 μL纯化后的CSFV-His-NS3重组蛋白加入10 μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，金属浴95 ℃ 7 min，冰浴5 min，12 000 r/min离心5 min，4 ℃保存备用。

SDS-PAGE电泳：将2玻璃板固定于加样器上；按照试剂盒A盒配制12%分离胶5 mL；20 min后弃去超纯水并用滤纸吸净；再按照B盒说明书配制5%浓缩胶2 mL；将浓缩胶加入玻璃板中，迅速准确插入梳子，固化30 min；然后拔出梳子，每孔加入10 μL样品。在开始时以240 V电压跑胶30 min，直到溴酚蓝距下缘0.5 cm时停止电泳。胶块切2块，一块用于Western-blot鉴定，另一块用考马斯亮蓝进行染色，水平摇床染色30 min，而后脱色摇床脱色观察并拍照。