朝鲜淫羊藿真菌群落结构多样性与药用成分含量相关性研究

摘要 ［目的］阐明朝鲜淫羊藿真菌群落的多样性，找出朝鲜淫羊藿真菌群落与药用成分的关系。［方法］检测不同生长时期的朝鲜淫羊藿样品，采用第二代高通量测序技术分析朝鲜淫羊藿根际土壤真菌和叶内生真菌多样性，采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法对药用成分进行测定。［结果］根际土壤真菌共得到有效序列278 515条和16门57纲154目341科935属真菌；叶片内生真菌共得到有效序列253 799条和12门47纲137目299科753属真菌。柱隔孢属为朝鲜淫羊藿的致病菌属，随着时间的推移相对丰度减少。被孢霉属的相对丰度在朝鲜淫羊藿生长初期相对丰度最高，对朝鲜淫羊藿药用成分的正向影响最显著。［结论］真菌群落与药用成分之间存在联系，有益菌属相对丰度的改变是引起朝鲜淫羊藿药用成分变化的关键。

关键词 真菌多样性；朝鲜淫羊藿；药用成分；根际土壤；相关性

中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）20-0164-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.20.040

Study on the Correlation between Structural Diversity and Medicinal Composition of Epimedium koreanum Nakai

CHEN Jia-wen， LIU Han-ning， WU Yuan et al

（School of Pharmacy， Changchun University of Traditional Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117）

Abstract ［Objective］To clarify the diversity of the fungal community of Epimedium koreanum Nakai， and find out the relationship between the fungal community and the medicinal components. ［Method］Samples of Epimedium koreanum from different growth stages were detected， the diversity of fungi in the rhizosphere soil and endophytic fungi of Epimedium koreanum Nakai were analyzed using the second-generation high-throughput sequencing technology， and the medicinal components were determined using UV-visible spectrophotometry and HPLC. ［Result］A total of 278 515 effective sequences and 935 genera of fungi belonging to 341 families， 154 orders， 16 phyla， 57 classes were obtained from rhizosphere soil fungi; a total of 253 799 effective sequences and 753 genera of fungi belonging to 299 families， 137 orders， 47 classes， and 12 phyla were obtained from endophytic fungi in leaves. Ramularia were the pathogenic bacteria genus of Epimedium koreanum Nakai， and their relative abundance decreased over time.The relative abundance of Mortierella was highest in the initial stage of Epimedium koreanum Nakai growth， with the most significant positive effect on the medicinal components of Epimedium koreanum Nakai. ［Conclusion］ There is a connection between fungal communities and medicinal components， and the change in abundance of beneficial bacteria is the key to causing changes in the medicinal components of Epimedium koreanum Nakai.

Key words Fungal diversity;Epimedium koreanum Nakai;Medicinal composition;Rhizosphere soil;Correlation

朝鲜淫羊藿为小檗科（Berberidaceae）淫羊藿属（Epimedium Linn.）多年生草本植物，植株高15～40 cm，大多生长在海拔400～1 500 m的林下或灌丛中。目前对朝鲜淫羊藿植物仅有少量相关研究，但已证实朝鲜淫羊藿中存在可产黄酮类成分的微生物［1］，而药材质量除受产地和采收期等非生物因素影响外，微生物也是影响药材品质的因素之一，可见生物因素对朝鲜淫羊藿次生代谢产物的合成和积累具有一定的影响，因此深入开展朝鲜淫羊藿微生物群落组成相关研究，进一步分析微生物与活性成分之间的关系具有重要的意义。

根际土壤真菌也可产生一些对植物生长具有较大影响的植物激素，如吲哚乙酸［2］。有相关研究已表明根际土壤真菌对宿主植物次生代谢产物的合成和积累也具有一定积极的作用，如接种丛枝菌根真菌对牧豆树根中葫芦巴碱成分和黄花蒿中青蒿素和挥发油成分均有不同程度的提高［3-4］，而在刺五加植物中，接种灭活后的角坦菌对刺五加苷E的合成和积累具有一定的促进作用［5］。

植物内生真菌通过与植物长期的协同进化，可产生某些与宿主植物相似或相同的代谢物质，如生物碱、萜类、芳香类、多肽类、黄酮类等成分［6］，如内生真菌Fusarium sp.可提高大戟的大戟素和大戟醇的含量，促进其萜类成分的合成［7］。目前，已从众多植物中分离得到相关微生物并进行相关试验研究证实其对植物生长具有一定积极的作用，如在菊花中分离得到球毛壳菌，可提高菊花植株的生物量和抗逆性［8］；也有部分菌株可调控植物赤霉素、吲哚乙酸等内源性激素的分泌［9］，同时也可自身产生植物激素［10］。有学者对刺五加［9］、古侧柏［11］的内生真菌研究发现，内生真菌可促进植物种子萌发。基于以上研究成果，推测被孢霉属的相对丰度在朝鲜淫羊藿生长初期相对丰度最高，对朝鲜淫羊藿药用成分的正向影响最显著；柱隔孢属为朝鲜淫羊藿的致病菌属，随着时间的推移相对丰度减少。为了验证这些假设，该研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对吉林省临江市的朝鲜淫羊藿叶片中内生菌和根际微生物群落的多样性进行研究，分析潜在的核心微生物菌群，尤其是不同生长时期的差异菌群和相对丰度的变化，以期为朝鲜淫羊藿的仿生态栽培提供了科学依据，也为植物生长发育中根际和内生菌群落的复杂性分析提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用“抖落取样法”于2020年5—7月在吉林省临江市地区采集朝鲜淫羊藿根际土壤（MT）和叶片内生真菌（MY），每个采集地选取5个采样点，共10个点5个时期（MY1、MY2、MY3、MY4、MY5、MT1、MT2、MT3、MT4、MT5），每隔15 d采样1次。

1.2 主要仪器与试剂 见表1。

1.3 试验方法

1.3.1 高通量测序分析。

1.3.1.1 DNA提取。

根际土壤总DNA提取参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit说明书进行，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒检测纯度和浓度。

1.3.1.2 PCR扩增。以根际土壤和叶片内生真菌总DNA为模板，共进行两轮PCR扩增。第一轮PCR反应体系：正反引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）各1 μL，2×Hieff Robust PCR Master Mix 15 μL，Template DNA 10～20 ng，补ddH2O至30 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20个循环；72 ℃ 5 min，10 ℃停止。第二轮PCR反应体系：正反引物TS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）各1 μL，2×Hieff Robust PCR Master Mix 15 μL，Template DNA 20～30 ng，补ddH2O至30 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5个循环；72 ℃ 5 min，10 ℃停止。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小，用DNA Clean Beads对DNA进行纯化，纯化产物用Qubit 3.0荧光定量仪进行浓度测定，之后进行Miseq测序。测序部分由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.2 供试品溶液的制备。

取全部过3号筛朝鲜淫羊藿粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称重，超声（500 W，40 kHz）处理1 h，再称量，用稀乙醇补足减失的量，摇匀，过滤，取续滤液即得。

1.3.3 色谱条件。

色谱柱为Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（B）-水（A），梯度洗脱（0～37 min，24%B；37～47 min，24%～38%B；47～60 min，38%～24%B）；流速1 mL/min；检测波长270 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。理论塔板数按淫羊藿苷峰计算不低于1 500［1-2］。

1.3.4 线性关系考察。

取对照品混合溶液2、4、6、8、10 μL注入仪器，按照“1.3.3”色谱条件进行测定，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线回归方程、决定系数（R2）和线性范围见表2。

1.4 数据处理与分析

使用Usearch 11.0.667 软件对有效序列按照97%相似性进行OTU聚类，再将每个OTU的代表序列真菌UNITE数据库进行比对，获得代表性序列在各分类水平的物种注释信息，多组间差异分析和制图则采用LefSe 1.1.0软件进行。两组间差异分析则采用STAMP 2.1.3软件进行分析和制图。使用Excel 2016和SPSS 21.0软件对试验数据进行统计，对样品组间的差异采用单因素方差检验分析。

2 结果与分析

2.1 根际土壤与叶片内生真菌类样品OTU聚类和物种注释