基于线粒体Ctyb基因的滆湖3种黄颡鱼遗传多样性分析

摘要 为掌握滆湖3种黄颡鱼野生资源的种质遗传状况，采用线粒体Ctyb基因探索黄颡鱼、光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼的遗传多样性和进化历史动态。通过PCR扩增、测序和序列分析，获得3种黄颡鱼的Ctyb基因全序列，长度均为1 138 bp。3种黄颡鱼Cytb基因的碱基组成具有偏倚性，碱基A+T的含量（55.6%）高于G+C的含量（44.4%）。49尾黄颡鱼的Cytb基因序列有23个多态位点，定义17种单倍型，单倍型多样性为0.903，核苷酸多样性为0.002 40；40尾光泽黄颡鱼的Cytb基因序列有25个多态位点，定义17种单倍型，单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.936和0.004 59；32尾长须黄颡鱼的Cytb基因序列有20个多态位点，定义11种单倍型，单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.829和0.002 25。整体来看，3种黄颡鱼的单倍型多样性较为丰富，但核苷酸多样性较低。黄颡鱼、光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼的种内遗传距离分别为0～0.006、0～0.012和0～0.008。3种黄颡鱼的种间遗传距离为0.078～0.138，长须黄颡鱼与黄颡鱼的亲缘关系较近、与光泽黄颡鱼的亲缘关系较远。Tajima’s D和Fu’s Fs中性检验值均为负值，且核苷酸不配对分布图呈现单峰型，表明3种黄颡鱼经历过明显的种群扩张过程。该研究结果可为滆湖3种黄颡鱼的种质资源保护及开发利用提供参考依据。

关键词 遗传多样性；Cytb基因；黄颡鱼；光泽黄颡鱼；长须黄颡鱼

中图分类号 S917.4文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）21-0105-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.21.024

Genetic Diversity of Three Species of Pelteobagrus in Ge Lake Based on Cytb Gene Sequence

LI Daming1， LIU Yang1，2， LIU Yanshan1 et al

（1.Key Laboratory of Fisheries Resources in Inland Waters of Jiangsu Province/Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province， Nanjing， Jiangsu 210017;2.College of Marine Science and Engineering， Nanjing Normal University， Nanjing， Jiangsu210046）

Abstract In order to understand the wild resources’ genetic situations of three species of Pelteobagrus， the genetic diversity and evolution history dynamics of Pelteobagrus fulvidraco， Pelteobagrus nitidus and Pelteobagrus eupogon were studied based on the mitochondrial Cytb gene sequences. By PCR amplification， sequencing and sequence analysis， the whole sequences of Ctyb gene were obtained from three species of Pelteobagrus， the length was 1 138 bp. The base composition of Cytb gene in three species of Pelteobagrus was obvious biased， the content of A+T （55.6%） was higher than the content of G+C（44.4%）. 23 polymorphic sites were detected in Cytb gene sequences of 49 individuals of P. fulvidraco， 17 haplotypes were defined， the haplotype diversity was 0.903， nucleotide diversity was 0.002 40. 25 polymorphic sites were detected in Cytb gene sequences and 17 haplotypes were defined in 40 individuals of P. nitidus，the haplotype diversity was 0.936， the nucleotide diversity was 0.004 59. 20 polymorphic sites were detected in Cytb gene sequences and 11 haplotypes were defined in 32 individuals of P. eupogon， the haplotype diversity was 0.829， the nucleotide diversity was 0.002 25. Overall， three species of Pelteobagrus had rich haplotype diversity and low nucleotide diversity. The genetic distance within three species were 0-0.006， 0-0.012， and 0-0.008， respectively. The genetic distance among three species was 0.078-0.138. P. eupogon had closer genetic relationship with P. fulvidraco and farther genetic relationship with P. nitidus. The values of Tajima’s D and Fu’s Fs neutrality tests were negative， and the nucleotide pairwise difference distribution showed a unimodal pattern，indicating that these three species of Pelteobagrus had experienced population expansion in evolution history. The results of this study provided reference basis for the germplasm resources’ protection，development and utilization of three species of Pelteobagrus in Ge Lake.

Key words Genetic diversity;Cytb gene;Pelteobagrus fulvidraco;Pelteobagrus nitidus;Pelteobagrus eupogon

黄颡鱼属（Pelteobagrus）为鲇形目（Siluriformes）鲿科（Bagridae）鱼类，在江苏省该属鱼类有黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、光泽黄颡鱼（Pelteobagrus nitidus）、长须黄颡鱼（Pelteobagrus eupogon）和瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）4种，一般统称黄颡鱼［1］。黄颡鱼属鱼类具有肉质鲜美、营养丰富、无肌间刺等特点，因此广受消费者欢迎，市场价格较高［2］。多年来，由于水体环境污染不断加剧，滥捕滥捞现象日益严重，导致黄颡鱼的栖息环境受到严重破坏，黄颡鱼野生资源数量锐减，开展黄颡鱼野生资源保护及相关研究显得十分必要［3］。

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是物种多样性、生态系统多样性和景观多样性的基础，也是生命进化和适应的基础。开展鱼类遗传多样性的研究可以反映鱼种的进化历史，为分析其进化潜力提供参考；同时，还有利于分析物种稀有或濒危的原因，为鱼种保护提供参考［4-5］。鱼类线粒体具有DNA分子小、结构简单、进化速度快、母系遗传、重组率低等特点，使其成为分子标记在鱼类进化遗传学、群体遗传结构、分子生态学和保护生物学等研究领域的理想分子标记［6-7］。其中，细胞色素b（cytochrome b，Cytb）基因进化速度适中，有通用引物可用于扩增和测序，是检测鱼类遗传多样性和系统发育的常用分子手段［8-10］。

滆湖位于江苏省常州市西南，湖面面积146 km2，平均水深1.17 m，具有饮用、灌溉、航运和渔业等多种功能。近几十年，由于捕捞强度过大、开捕年龄偏低、湖泊富营养化和环境污染加剧，导致滆湖渔业资源明显衰退，鱼类小型化现象严重［11-13］。黄颡鱼是滆湖的常见鱼类，经济价值较高，是渔民重要的捕捞对象。已有研究者利用Cytb基因和D-loop区序列研究了滆湖黄颡鱼的遗传多样性［14-15］，但有关滆湖光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼的遗传多样性尚未见报道。笔者用线粒体Cytb基因作为分子标记，探索滆湖黄颡鱼、光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼的遗传多样性及进化历史，以期为滆湖3种黄颡鱼的野生种质资源保护及合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和处理

2019—2020年在滆湖设置3个渔获物采样点，开展渔业资源调查。共采集黄颡鱼49尾、光泽黄颡鱼40尾、长须黄颡鱼32尾，现场测量体长和体重。剪取样本背部肌肉组织，保存于无水乙醇中固定，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 PCR扩增和测序

利用TaKaRa公司的DNA试剂盒提取肌肉组织的基因组DNA，最后用TE溶液溶解DNA。取少量DNA采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，使用微量紫外分光光度计检测其吸光值。

Cyt b基因扩增和测序的引物为通用引物L14724和H15915［16］，引物L14724为5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′，H15915为5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系（50 μL）如下：模板DNA 2 μL（100 ng），2×PCR Mix 25 μL（Taq酶2.5 U，dNTPs 10 μmol，MgCl2 0.1 mmol），上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，用水补足50 μL。PCR反应程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

1.3 数据处理和分析

利用DNAStar软件包中SeqMan、EditSeq程序对测序结果进行拼接，获得Cytb基因序列。利用ClustalX 1.83软件［17］对Cytb同源序列进行多重比对分析。采用MEGA 7.0软件［18］统计碱基含量，基于Kimura双参数模型计算种内及种间遗传距离，采用邻接法（neighborjoining，NJ）构建3种黄颡鱼单倍型的分子系统发育树。利用DnaSP 6.0软件［19］统计多态位点（variable site，V）、单倍型数量（haplotype number，N），计算单倍型多样性（haplotype diversity，h）、核苷酸多样性（nucleotide diversity，π）和平均核苷酸差异数（K）。

2 结果与分析

2.1 Ctyb基因序列组成

通过PCR扩增、测序和分析，获得了3种黄颡鱼的Cytb基因全序列。结果显示，3种黄颡鱼的Cytb基因长度均为1 138 bp，编码379个氨基酸，其中黄颡鱼Cytb基因的平均碱基含量为A 27.6%、T 26.6%、C 32.1%和 G 13.7%；光泽黄颡鱼的平均碱基含量为A 29.3%、T 28.4%、C 29.1%和 G 13.2%；长须黄颡鱼的碱基平均含量分别为A 27.4%、T 27.4%、C 31.5%和 G 13.7%。由此可见，3种黄颡鱼均表现出碱基组成偏倚性，碱基A+T的含量大于碱基G+C的含量。所有序列均无碱基插入或缺失。

2.2 Ctyb基因多态性

49尾黄颡鱼Cytb基因序列共检测到23个多态位点，其中单一信息位点10个、简约信息位点13个；49尾黄颡鱼定义17种单倍型（HapPf1～HapPf17），单倍型多样性为0.903，核苷酸多样性为0.002 40。40尾光泽黄颡鱼Cytb基因序列共检测到25个多态位点，其中单一信息位点9个、简约信息位点16个；40尾光泽黄颡鱼定义17种单倍型（HapPn1～HapPn17），单倍型多样性为0.936，核苷酸多样性为0.004 59。32尾长须黄颡鱼Cytb基因序列共检测到20个多态位点，其中单一信息位点12个、简约信息位点8个；32尾黄颡鱼定义11种单倍型（HapPe1～HapPe11），单倍型多样性为0.829，核苷酸多样性为0.002 25（表1）。整体来看，3种黄颡鱼的遗传多样性较为丰富，均呈现出高单倍型多样性和低核苷酸多样性模式，遗传多样性从高到低依次为光泽黄颡鱼、黄颡鱼和长须黄颡鱼。