羊口蹄疫病毒·羊口疮病毒和山羊痘病毒多重PCR检测方法的建立及应用

摘要 ［目的］建立一种能同时检测羊口蹄疫病毒（footandmouth disease virus，FMDV）、羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）和山羊痘病毒（Goat pox virus，GTPV）的方法。［方法］从NCBI中下载已报道的FMDV、ORFV和GTPV全基因序列，通过同源比对软件获取保守基因序列，并在该基础上设计特异性引物，建立一种多重PCR检测方法。［结果］该法对其他羊常见病原无特异性扩增，具有较好的特异性；对FMDV、ORFV和GTPV的最低检测限分别为103、104和103拷贝/μL，敏感性良好；组内和组间重复性良好；对147份样品进行检测，利用该研究建立的多重PCR方法分别检出5份FMDV、16份ORFV、5份GTPV阳性样品，与常规PCR检出结果一致。［结论］该方法能够同时检测FMDV、ORFV和GTPV，可用于羊病的流行病学调查、鉴别诊断和疫情防控。

关键词 羊口蹄疫病毒；羊口疮病毒；山羊痘病毒；多重PCR

中图分类号 S858.26文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）21-0112-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.21.026

Establishment and Application of Multiplex PCR Detection Methods for Foot and Mouth Disease Virus， Orf Virus and Goat Pox Virus

PAN Yong， YANG Li， LI Ting et al

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550005）

Abstract ［Objective］To establish a method that can simultaneously identify foot and mouth disease virus （FMDV）， orf virus （ORFV）， and goat pox virus （GTPV）.［Method］All described FMDV， ORFV， and GTPV gene sequences were downloaded from NCBI. A multiplex PCR detection method was enacted by acquiring conserved gene sequences and designing specific primers using homologous alignment software. ［Result］It has great specificity and no specific amplification in other common sheepderived pathogens. Sensitivity assay for FMDV， ORFV， and GTPV are 103， 104， and 103 copies/μL， respectively， showing good sensitivity. Satisfactory repeatability within and between groups. Multiplex PCR confirmed 5 FMDV， 16 ORFV， 5 GTPV positive samples in 147 samples.［Conclusion］This program can expose FMDV， ORFV and GTPV in a single reaction， which can be used in epidemiological investigation， differential diagnosis and epidemic prevention.

Key words FMDV；ORFV；GTPV；Multiplex PCR

近年来，在贵州省大力推动羊产业高质量发展的背景下，羊存栏数截至2022年3月已突破390万只。随着养殖业的发展，养殖规模不断扩大，疾病防控压力也日益增大，特别是羊病毒性疾病，因其传播快，致死率高，对羊养殖业发展构成严重威胁。羊口蹄疫、羊口疮和山羊痘是分别由口蹄疫病毒、羊口疮病毒和山羊痘病毒引发的疫病，引种、免疫失败、新变异病毒株是感染上述病毒的常见因素［1-3］。由于3种疾病在临床上有类似的特征，加之混合感染存在，给临床诊断造成困难。因此，快速鉴别诊断对防控上述3种羊病具有重要意义。

口蹄疫（footandmouth disease，FMD）、羊口疮（Contagious ecthyma，CE）和山羊痘（Goat pox，GTP）疫病在临床上存在类似症状。口蹄疫是由口蹄疫病毒（footandmouth disease virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，俗称“口疮”。家养或野生偶蹄动物为该病毒的易感动物，临床表现为唇、舌面、内面、齿龈、脸颊部黏膜、四肢下端和乳房处等无毛部位形成水疱，水疱破溃后形成红色溃烂，严重时蹄壳脱落，导致动物跛行［4］。羊口疮是由羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）引起的一种接触性、嗜上皮性传染病，可通过接触传播。山羊、绵羊、鹿科及骆驼科等其他反刍类动物为该病的易感动物，临床表现为口、舌、唇、乳房和鼻镜等皮肤部位形成脓疱、水泡和结痂［5］。山羊痘是由山羊痘病毒（Goat pox virus，GTPV）引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病，临床表现为发热、结膜炎、鼻炎、过度流涎、皮肤黏膜发生疱疹和丘疹病变［6］。随着养羊业的迅速发展，羊病的种类也开始增多且难以控制。另外，还存在多种病毒混合感染的现象，如颜新敏等［7］报道我国存在GTPV、ORFV及山羊传染性胸膜肺炎混合感染羊的病例。

通过文献查新发现，目前尚缺乏同时针对FMDV、ORFV和GTPV的快速检测方法。鉴于传统检测方法在检测混合感染病例时费时费力且容易误诊，现急需建立一种同时针对FMDV、ORFV和GTPV的快速鉴别诊断方法。笔者旨在利用PCR技术，建立可同时检测FMDV、ORFV和GTPV的多重PCR方法，以期为未来流行病学调查和疾病防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究所涉及的ORFV、GTPV、FMDV疫苗株、蓝舌病灭活病毒和小反刍兽疫病毒疫苗株、魏氏梭菌、羊结核杆菌和山羊支原体样品均由实验室保存。临床样品包括132份抗凝血和8份已鉴定的羊口疮阳性痂皮组织，于2021年12月至2022年11月采集自贵州地区各规模化养羊场。

1.2 主要试剂和仪器设备

核酸提取试剂盒DNA/RNA Extraction Kit、胶回收试剂盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、质粒提取试剂盒RapidLyse Plasmid Mini Kit、反转录试剂盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA聚合酶混合物2 × AceTaq Master Mix（Dye Plus）、基因克隆载体ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit和DH5α 化学感受态细胞均为诺维赞产品；DL2000 DNA Marker为天根公司产品；PCR仪为BIO-RAD产品；凝胶电泳仪为北京六一公司产品。

1.3 引物设计

下载NCBI中已上传的不同血清型FMDV全基因序列、ORFV全基因序列和GTPV全基因序列，利用clustlW软件对同一病毒不同血清型基因序列进行多序列比对，在保守性高的区域设计引物并由生工生物工程股份有限公司合成。引物信息及预扩增目的片段大小见表1。

1.4 核酸提取

病毒样品和待检临床样品核酸的提取均使用DNA/RNA提取试剂盒，DNA样品保存于-20 ℃，RNA样品随即进行反转录，所获cDNA产物于-20 ℃保存，剩余RNA 于-80 ℃保存。

1.5 目的片段的扩增及克隆

分别以FMDV、ORFV和 GTPV病毒样品DNA/cDNA为模板，利用合成的引物进行PCR扩增。反应体系为2 × AceTaq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA/cDNA模板2.0 μL，最后ddH2O补足至25 μL。反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30个循环；72 ℃ 8 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收并纯化。参照诺维赞ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit试剂盒方法分别将回收产物与载体连接，转化至DH5α 化学感受态细胞，挑取重组子进行测序验证。将阳性重组质粒分别命名为pFMDV、pORFV和pGTPV，测定各质粒浓度并计算拷贝数。

1.6 多重PCR反应条件的优化

以重组质粒pFMDV、pORFV和pGTPV为模板，对反应体系中的模板和引物用量以及反应程序中的退火温度进行优化，以ddH2O作为阴性对照模板，通过观察琼脂糖凝胶电泳结果，确定多重PCR的最佳反应体系和条件。

1.7 特异性试验

在已提取获得DNA/cDNA模板的基础上，ddH2O作为阴性对照模板，pFMDV、pORFV和pGTPV质粒作为阳性对照，利用优化后的多重PCR方法分别对蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、魏氏梭菌、羊结核杆菌和山羊支原体进行检测，以判断该方法的特异性。

1.8 敏感性试验 将pFMDV、pORFV和pGTPV质粒稀释至同一拷贝数量级并等比例混合，以10倍梯度稀释混合物并作为模板，检测多重PCR方法的最低检测限，ddH2O作为阴性对照模板。

1.9 重复性试验

将pFMDV、pORFV、pGTPV混合物等比例混合并作为模板，通过多重PCR反应方法检测重复性，重复试验3次。分别将FMDV疫苗株、ORFV和GTPV病原分离物混合后匀浆，提取总RNA和总DNA，总RNA随即反转录为cDNA，以cDNA和总DNA混合物为模板，通过多重PCR反应方法检测重复性，重复试验3次。

1.10 临床样品的检测

所检测临床样品包括采集的132份抗凝血、8份阳性羊口疮痂皮病料按照100 μL病毒细胞培养上清和200 μL阴性全血混合分别制备3份ORFV模拟样品和1份GTPV模拟样品，将FMDV疫苗株10倍稀释后与200 μL阴性全血混合制备1份FMDV模拟样品，将3种病毒液等量混合后取100 μL和200 μL阴性全血制备2份混合型模拟样品。提取样品核酸用该试验建立的多重PCR与常规PCR方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 FMDV、ORFV、GTPV三重PCR反应建立与优化

通过对引物和模板用量以及退火温度的优化，确定了该多重PCR最佳反应体系为2 × AceTaq Master Mix 12.5 μL，FMDV上下游引物终浓度200 nmol/L，ORFV引物上下游引物终浓度400 nmol/L，GTPV上下游引物终浓度200 nmol/L，质粒、cDNA/DNA模板均为1.5 μL，ddH2O补足至25 μL。

为明确多重PCR最佳反应程序，在最佳反应体系确定的基础上，对退火温度进行梯度优化处理，琼脂糖凝胶电泳以及测序结果显示，54～58 ℃均可同时扩增出3条大小正确的目的条带，当退火温度为57 ℃时，目的片段产量较高、引物二聚体较少（图1）。结果表明，57 ℃可作为反应程序的最佳退火温度，PCR最佳反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30个循环；72 ℃ 8 min。