HPLC测定驱虫药中二氯苯醚菊酯和吡虫啉的含量

摘要 ［目的］建立HPLC同时测定二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂中二氯苯醚菊酯、吡虫啉2种药效成分含量的方法。［方法］采用反向液相色谱法，色谱柱为X-Terra C18，流动相为0.05 mol/L甲酸铵溶液（pH=4.5）-乙腈，柱温35 ℃，梯度洗脱，检测波长235 nm。［结果］二氯苯醚菊酯、吡虫啉浓度分别在1.209 8～2.822 8、0.237 5～0.554 2 mg/mL时与峰面积呈现线性关系（R2≥0.999 8）；平均加样回收率分别为99.84%、100.33%，RSD均为0.51%；耐用性各项试验含量检测RSD均小于2%；精密度较高，样品溶液在24 h内稳定性良好。［结论］此方法可以准确便捷地测定二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂中药效成分的含量，适于药品的质量控制。

关键词 驱虫药；HPLC；方法学试验；二氯苯醚菊酯；吡虫啉；含量测定

中图分类号 R927文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）21-0180-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.21.042

Determination of Permethrin and Imidacloprid in Anthelmintic Drops by HPLC

LIU Guanlin1，2，JIANG Linjie2，WANG Jian2 et al

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300380;2.Tianjin Speerise Challenge Biotechnology Corporation，Tianjin 300080）

Abstract ［Objective］To establish a HPLC method for simultaneous determination of two active components （permethrin，imidacloprid） in dichlorobenzene permethrin imidacloprid drops.［Method］Reverse liquid chromatography was performed on XTerra C18 column with mobile phase consisted of 0.05 mol/L ammonium formate solution （pH=4.5） acetonitrile，column temperature was 35 ℃，gradient elution was performed，and detection wavelength was 235 nm.［Result］There was a linear relationship between the peak area and the concentration of permethrin and imidacloprid at 1.209 8-2.822 8 and 0.237 5-0.554 2 mg/mL，respectively （R2≥0.999 8）;the average sample recovery rates were 99.84% and 100.33%，respectively，the RSD was 0.51%.The durability tests RSD were all less than 2%.The sample solution had high precision and good stability within 24 hours.［Conclusion］This method can accurately and conveniently determine the content of active components in imidacloprid drops of dichlorobenzene permethrin，which is suitable for the quality control of drugs.

Key words Anthelmintic drop;HPLC;Experiment of methodology;Permethriny;Imidacloprid;Content determination

二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂是一种用于治疗预防动物体外寄生虫病的复方药物，直接涂抹在动物脊柱皮肤上，有效抵抗犬体表蚤、蜱、虱的寄生，抑制白蛉、厩蝇和蚊子的叮咬，辅助治疗过敏性皮炎［1］，其中有效杀虫成分是二氯苯醚菊酯和吡虫啉，药物通过昆虫吸食给药动物血液进入虫体，干扰神经离子通道，从而达到杀虫作用，持续驱虫效果长达28 d［2-7］。

目前德国拜尔公司已上市的驱虫类产品除了拜宠爽（滴剂），还有爱沃克（滴剂）、旺滴静（滴剂）、索来多（项圈），主要成分为吡虫啉和其他杀虫药。近年来，国内已有此类杀虫滴剂仿制药的项目开发，经查阅文献，仅有检测农药中二氯苯醚菊酯和吡虫啉的方法［8-15］，但作为兽用驱虫药的含量测定方法目前鲜见相关研究报道，因此该研究建立一种高效液相色谱法（HPLC）同时检测二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂中二氯苯醚菊酯和吡虫啉的含量方法，为二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂的质量控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 二氯苯醚菊酯对照品（G1050294，99.73%，Dr.Ehrenstorfer）；吡虫啉对照品（G988243，98.55%，Dr.Ehrenstorfer）；二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂（批号202204003、202204004、202204005，天津市中升挑战生物科技有限公司）；甲酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市川普伟业科技有限公司）；甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水。

1.2 仪器 安捷伦1260Ⅱ高效液相色谱仪，包括G7111A四元泵、G7129A自动进样器、AT-330柱温箱、G7115A DAD检测器、C.01.07 SR2（255）色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；ES225SM-DR电子天平，普利赛斯仪器有限公司；超声波清洗器，昆山仪器有限公司；真空泵，ASL仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（X-Terra C18，100 mm×4.6 mm，3.5 μm，批号02403032213653）；以0.05 mol/L甲酸铵溶液（用甲酸调pH至4.5）作为流动相A，乙腈作为流动相B；按表1进行梯度洗脱；柱温为35 ℃；检测波长为235 nm；进样量为5 μL。

1.3.2 溶液的制备。

1.3.2.1 对照储备液。电子天平精密称定吡虫啉对照品100 mg，用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定容至25 mL，摇匀，配制成浓度为4.0 mg/mL吡虫啉溶液，作为吡虫啉对照储备液；电子天平精密称定二氯苯醚菊酯对照品500 mg，用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定容至50 mL，摇匀，配制成10 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液，作为二氯苯醚菊酯对照储备液。

1.3.2.2 对照品溶液。精密移取“1.3.2.1”吡虫啉对照储备液1 mL，用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定容至10 mL，摇匀，配制成浓度为0.4 mg/mL吡虫啉溶液，作为吡虫啉对照溶液备用；精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯对照储备液2 mL，用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定容至10 mL，摇匀，配制成2.0 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液，作为二氯苯醚菊酯对照溶液备用。

1.3.2.3 供试品溶液。由于药品溶液黏稠存在挂壁现象，不适宜使用移液枪，故采用质量称定移取。精密称定二氯苯醚菊酯和吡虫啉滴剂120 mg，用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定至25 mL，摇匀，作为供试品溶液备用。

1.3.2.4 空白对照溶液。精密称定不含二氯苯醚菊酯和吡虫啉的空白制剂120 mg，用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定容至25 mL，作为空白对照溶液备用。

1.3.3 专属性试验。按照“1.3.2”方法分别配制吡虫啉对照品溶液、二氯苯醚菊酯对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液，按照“1.3.1”色谱条件分别进样高效液相色谱仪，记录色谱图。

1.3.4 精密度试验。按照“1.3.2”方法分别配制2种对照品溶液、6份供试品平行溶液，按照“1.3.1”色谱条件分别进样，记录色谱峰面积。

1.3.5 稳定性试验。按照“1.3.2”方法配制2种对照品溶液、6份相同浓度滴剂供试品平行溶液，分别放置0、1、4、8、16、24 h后，按照“1.3.1”色谱条件分别进样，记录色谱峰面积。

1.3.6 线性关系确定。

1.3.6.1 二氯苯醚菊酯线性关系。精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯对照储备液4.0、5.0、6.0、7.5、9.0 mL用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定容至20 mL，按照“1.3.1”色谱条件分别进样，记录色谱峰面积，并以峰面积为y轴、进样浓度为x轴绘制标准曲线。

1.3.6.2 吡虫啉线性关系。精密移取“1.3.2.1”吡虫啉对照储备液3、4、5、6、7 mL用流动相A-流动相B（10∶90）混合溶液定容至50 mL，按照“1.3.1”色谱条件分别进样，记录色谱峰面积，并以峰面积为y轴、进样浓度为x轴绘制标准曲线。

1.3.7 加样回收率试验。分别移取适量“1.3.2.1”项对照储备液置25 mL容量瓶中，稀释定容为80%加样回收溶液（4 mL二氯苯醚菊酯+2 mL吡虫啉）、100%加样回收溶液（5 mL二氯苯醚菊酯+2.5 mL吡虫啉）、120%加样回收溶液（6 mL二氯苯醚菊酯+3 mL吡虫啉），备用，按照“1.3.1”色谱条件分别进样，记录色谱峰面积，计算加样回收率。

1.3.8 定量限和检测限。移取“1.3.2.2”项中2种主药对照品溶液，逐步稀释，连续进样6次，记录二氯苯醚菊酯和吡虫啉信噪比平均数，以信噪比S/N为3时对应的浓度为检测限（LOD）；以信噪比S/N为10时对应的浓度为定量限（LOQ）。

1.3.9 耐用性试验。移取“1.3.2”项对照品溶液和供试品溶液各1份，供试品选用批号202204003样品，在“1.3.1”色谱条件下，通过改变流速（±5%）、柱温（±5 ℃）、流动相A 酸度（pH±0.2），换用不同批号的色谱柱（批号02403032213653、02413128113605），记录各个条件下主峰的分离情况。

1.3.10 样品含量测定。移取“1.3.2.2”项对照品溶液，另选取3批不同批号（202204003、202204004、202204005）二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂样品，溶解稀释，按照“1.3.1”色谱条件进样2次，记录色谱峰面积，并采用外标法计算样品中2种药效成分含量结果。

2 结果与分析

2.1 专属性试验 从吡虫啉对照品、二氯苯醚菊酯对照品、供试品、空白对照色谱图（图1）可以看出，吡虫啉出峰时间在2.5～3.0 min，二氯苯醚菊酯顺反异构体出峰时间在14～16 min，供试品与对照品出峰时间一致，且空白对照无主峰出现对含量测定无干扰，说明该色谱条件下专属性良好。

2.2 精密度试验 精密度试验结果表明，二氯苯醚菊酯平均峰面积为10 763.4，RSD为0.17%，吡虫啉平均峰面积为5 936.7，RSD为0.52%，峰面积RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。