陆地棉转录因子WRKY29的鉴定及表达分析

摘要

［目的］揭示WRKY29基因表达机理，为分子辅助育种创新种质提供基因资源。［方法］以WRKY家族成员中的WRKY29为目标，通过生物信息学方法分析陆地棉WRKY29转录因子的理化性质、系统进化关系、亚细胞定位建模和染色体分布定位、基因的组织特异性表达。［结果］生物信息学分析表明，陆地棉WRKY29转录因子含有279个氨基酸残基，理论等电点为6.08，具有典型的WRKY保守结构域，属于不稳定蛋白。蛋白质二级结构以α螺旋和无规卷曲为主。系统进化关系分析得知WRKY29与同为锦葵目的物种聚类在同一进化分支，亚细胞定位预测WRKY29转录因子分布在细胞核，而染色体定位发现WRKY29转录因子分布在A02染色体40～48 Mb区域内。WRKY29转录因子具有正调控功能，组织表达模式发现在根部具有显著性表达。［结论］陆地棉转录因子WRKY29的鉴定及表达分析为棉花生长发育过程中的抗逆研究提供了重要线索。

关键词 WRKY29；转录因子；生物信息学；育种

中图分类号 S 562  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）23-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.23.020

Identification and Expression Analysis of Transcription Factor WRKY29 in Gossypium hirsutum L.

LIU Wen-hao， YU Yu， WANG Xu-wen et al

（Cotton Research Institute， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science/Northwest Inland Region Key Laboratory of Cotton Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/State Key Laboratory of Cotton Biology， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract ［Objective］In the early stage， our research team identified a WRKY29 gene in upland cotton， and revealed the mechanism of gene expression through analysis， hoping to provide genetic resources for molecular-assisted breeding innovative germplasm.［Method］This study targeted WRKY29， a member of the WRKY family， and analyzed the physicochemical properties， phylogenetic relationships， subcellular location modeling and chromosome distribution location， and tissue specific expression of WRKY29 transcription factors in Gossypium hirsutum L. by bioinformatics methods.［Result］Bioinformatics analysis showed that the upland cotton WRKY29 transcription factor contains 279 amino acid residues， the theoretical isoelectric point is 6.08， and has a typical WRKY conserved domain， which is an unstable protein. The secondary structure of WRKY29 was mainly α-helix and random coil. Phylogenetic analysis showed that WRKY29 and mallow species clustered in the same evolutionary branch. Subcellular localization predicted that WRKY29 was located in the nucleus， chromosome mapping showed that WRKY29 transcription factor was distributed in the 40-48 mb region of A02 chromosome. WRKY29 transcription factor has a positive regulatory function， and the tissue expression pattern was found to be significantly expressed in the roots.［Conclusion］Identification and expression analysis of transcription factor WRKY29 in upland cotton provide important clues for the study of resistance to stress during the growth and development of cotton.

Key words WRKY29;Transcription factor;Bioinformatics;Breeding

基金项目 国家重点研发计划项目“西北内陆优质机采棉新品种培育-机采优异育种资源的创制”（2017YFD0101601）；兵团重点领域创新团队建设计划项目“机采棉遗传育种与高效栽培创新团队”（2017CB011）；棉花生物学国家重点实验室开放课题“缩节胺拌种对棉花生长发育转录组分析”（CB2022A27）。

作者简介 刘文豪（1992—），男，安徽界首人，助理研究员，硕士，从事棉花育种研究。

*通信作者，研究员，从事棉花育种研究。

收稿日期 2022-07-15

WRKY基因家族是含有WRKY保守结构域的转录因子家族，其广泛存在于植物体中，并且在植物生长发育、逆境胁迫应答和代谢调控等一系列生理生化过程中发挥重要作用［1］。基于全基因组的WRKY基因家族结构和功能分析在许多已测序的物种中得到了广泛应用［2］。目前已完成拟南芥［3］、水稻［4］、萝卜［5］、小麦［6］和毛果杨［7］等多个物种的WRKY基因家族分析。棉花是我国重要的经济作物之一，我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，总产和单产均居世界首位［8］，2020年全国棉花播种面积为316.99万hm2。因此，保持我国棉花产业的健康稳定发展，对于促进农业增效，农民增收及农村经济稳定具有重要意义。但是，近年来棉花病害较为严重，危害日益增加，而且缺少抗逆的高产优质棉花主推品种。因此，对抗病、抗逆优良品种的研究至关重要。优质棉的培育是解决问题的根本途径，分析关键基因的调控网络、差异表达及理化性状具有重要意义。

有研究表明，WRKY转录因子家族成员不仅在植物的生物胁迫和非生物胁迫中起重要作用，还参与碳水化合物的合成、次生代谢产物的合成、植株的衰老和发育［9］。WRKY蛋白能与目标基因启动子中的W-box（TGACC（A/T））结合，激活或抑制下游基因的表达，调节其应激反应。此外，WRKY蛋白可以与其他转录因子相互作用，调节植物的防御反应［10］。Chen等［11］的研究表明，拟南芥Ⅲ类WRKY转录因子WRKY46、WRKY54和WRKY70都参与植物甾体激素（BR）调控植物生长和干旱反应。Duan等［12］研究发现，毛白杨PtrWRKY73在植物对生物营养型病原菌的抗性中起着积极作用，但在对坏死营养型病原菌的抗性中起着消极作用。目前很多研究都集中在WRKY基因的功能鉴定上，但是对WRKY基因生物学许多领域的认识有限。如棉花中WRKY基因的系统发育特征、整体表达模式、调控表达的分子机制和途径等都没有得到很好的描述［13］。

迄今为止，很多陆地棉WRKY家族的成员被分析研究，但是陆地棉WRKY29转录因子尚未被综合分析，其在陆地棉对生物和非生物胁迫的反应过程中发挥着的作用尚未得知，其涉及的调控网络及差异表达尚不清楚。笔者以陆地棉标准系TM-1基因组数据库［14］和转录组数据库PRJNA248163进行WRKY29转录因子的序列获取及差异表达分析，使用多类型生物信息学工具进行理化性质、亚细胞定位、调控网络等相关的分析，以期为基因功能研究及生物技术培育优质棉花新品种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 GhWRKY29蛋白理化性质分析

以拟南芥AtWRKY29（AT4G23550）为探针，从陆地棉标准系TM-1基因组数据库获取GhWRKY29基因的cds和蛋白序列，在NCBI网站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，SMART网站（http：∥smart.embl.de/）进行结构域的预测分析。使用ProtParam网站（https：∥web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸数、分子量、理论等电点、带正负电荷的氨基酸残基、分子式、总原子数、不稳定系数、脂肪指数、亲疏水性等。

1.2 GhWRKY29蛋白的结构、系统进化关系和序列比对分析

SOPMA网站（https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/）输入氨基酸序列分析GhWRKY29蛋白的二级结构，包括α螺旋、β转角、延伸链和无规卷曲。在线网站SWISS-MODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）分析GhWRKY29蛋白的三级结构。NCBI获取不同物种的WRKY29蛋白序列和登录号，使用MEGA 7.0软件进行系统进化关系分析，用EvolView（http：∥evolgenius.info/）进行系统发育树的编辑。

1.3 GhWRKY29蛋白亚细胞定位和染色体图谱绘制

在线网站Predict Protein（https：∥www.predictprotein.org）进行GhWRKY29蛋白的亚细胞定位分析。从陆地棉标准系TM-1基因组数据库获取GhWRKY29的基因信息，使用在线网站MG2C（http：∥mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）进行染色体定位的图谱绘制，chromosome，chromosome id，gene lines，gene id等指标仅变动字体格式，其他均为默认参数。

1.4 GhWRKY29基因的表达模式分析

从NCBI网站下载陆地棉TM-1标准系转录组数据包（PRJNA248163），结合

陆地棉转录组数据库，对数据进行矩阵转换，获取GhWRKY29

基因在不同组织表达的FPKM值，进一步分析

GhWRKY29基因

的特异表达情况。使用TB-Tools软件的Super HeatMap

Browser功能进行绘制基因差异表达热图，Adobe Illustrator 2019软件对图片进行完善。