中华湖蛭的鉴定及药物浸浴杀灭效果研究

摘要首次报道了一种寄生于天然水体鲢、鳙鱼鳃部的中华湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）。2019—2022年，每年10月份后在部分水库鲢、鳙鱼鳃上发现少量幼虫感染，翌年4—6月为感染高峰，7月份后自行脱落消失。它吸食鱼鳃上的血液，严重影响鱼体生长及市场销售价格，给渔业生产带来巨大的经济损失。经形态学与分子生物学鉴定其为中华湖蛭。利用几种常用药物（敌百虫、川楝子、生石灰、硫酸铜）对中华湖蛭进行离体和在体（寄生在鲢鱼鳃上）的浸浴杀灭效果试验。离体试验结果表明，生石灰200 mg/L、川楝子400.00 mg/L、敌百虫4.00 mg/L浸浴1 h可以全部杀灭中华湖蛭；在体试验表明，400.00 mg/L川楝子、2.00 mg/L敌百虫、100.00 mg/L生石灰浸浴1 h后捞出至清水中暂养24 h观察，虫体全部死亡脱落而鲢鱼安全。

关键词中华湖蛭；浸浴；杀灭效果；离体试验；在体试验

中图分类号S 917.4文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）24-0082-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.018

Study on the Identification of Limnotrachelobdella sinensis and the Germicidal Efficacy of Drug Immersion Bath

HU Jinchun1，2，YE Jiazheng1，REN Siqi1 et al

（1.Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province/Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004;2.Aquatic Technology Promotion Station in Quzhou City，Quzhou，Zhejiang  324000）

AbstractLimnotrachelobdella sinensis，a freshwater leech parasitic on the gills of Aristichthys nobilis and Hypophthalmichthys molitrix in natural water body，was reported for the first time.During 2019-2022，a small number of larvae were found to be infected on the gills of A.nobilis and H.molitrix in some reservoirs after October each year.The infection peaked from April to June in the following year，and then disappeared after July.It absorbed the blood on the fish gills，which seriously affected the fish growth and market sales price，and brought huge economic losses to the fishery production.It was identified by morphology and molecule methods as L.inensis.The killing effect of several commonlyused drugs （trichlorfon，toosendan，quicklime and cupric sulfate） on L.sinensis was tested by dipping bath in vitro and in vivo （parasitized on the gills of H.molitrix）.The in vitro test showed that soaking with 200.00  mg/L quicklime，400.00  mg/L toosendan and 4.00  mg/L trichlorfon for 1 hour could kill all L.inensis，while in vivo test showed that 400.00  mg/L toosendan，2.00  mg/L trichlorfon and 100.00  mg/L quicklime were soaked for 1 hour and then temporarily cultured in clean water，and all the parasites were killed for 24 hours and H.molitrix was safe.

Key wordsLimnotrachelobdella sinensis;Immersion bath;Germicidal efficacy;In vitro test;In vivo test

鲢（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Hypophthalmichthys nobilis）是典型的浮游生物食性鱼类，在我国主要的大型水库、湖泊中具有重要的生态学意义。随着“洁水渔业”的发展，我国水库湖泊都以放养鲢鳙鱼为主，一方面鲢、鳙鱼通过非经典生物操纵控制藻类水华的发生［1］，另一方面水库等清水养殖的鲢鳙鱼品质较好，能带来较大的经济效益，形成了以千岛湖有机鱼等品牌为代表的特色产业，深受市场喜爱。自2019年以来，浙江省部分中小型水库陆续发现鳙、鲢鱼鳃上感染类似中华湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）的寄生虫，其他鱼类上未发生感染。3月上旬在大规格鳙、鲢鱼鳃上可见少量白色幼虫感染，4—7月发现大量感染，特别是对鳙鱼的感染率极高，每条鱼上可见30～50条褐色成虫，虽然不会引起死亡，但会影响其销售，造成了较大的经济损失。

目前已知中华湖蛭在我国山东、江苏、湖南和黑龙江地区广泛分布，主要利用其强力的尾吸盘吸附于鲤（Cyprinus carpio）、鲫（Carassius auratus）鱼鳃盖骨上，头部和身体的前段游离在鳃腔里面，通过吻在鳃瓣上吮吸血液［2］。另外，水库等大型水体鱼类感染中华湖蛭缺乏有效的防控措施，存在用药成本大、生态风险高的问题，考虑到其死亡率不高，笔者认为比较经济的措施是在鲢鳙鱼起捕后采用药物短期浸浴杀灭虫体。笔者开展药物浸浴对中华湖蛭的杀灭效果试验，以期为大型水体鲢鳙鱼中华湖蛭的安全有效防控提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

2020年6月从活体鳙鱼鳃部采集到体长（45±5） mm、体宽（15±5） mm的鱼蛭（暂命名为JH20200616）500多条，用于鉴定及药物杀灭效果试验。另外，从该水库选择鳃部感染中华湖蛭数量相近［（20±2）条］、规格（3±1） kg/尾的鲢鱼150尾，暂养在实验室养殖桶内。试验用水为经曝气24 h以上的自来水，试验期间保持曝气，pH为6.7～7.2，溶解氧7.5～9.0  mg/L，水温23.5～25.5 ℃。

1.2试验药物

选择4种常用杀虫药物用于试验，敌百虫（含量≥90%，南通江山农药化工股份有限公司）；五水硫酸铜（含量≥98%，国药集团化学试剂有限公司）；生石灰、川楝子均购自当地市场。其中，川楝子研磨成粉，称取2 g药粉，加入400 mL蒸馏水经文火煎煮1 h，冷却后经多层灭菌筛绢网过滤，再用灭菌水定量，调制成1 g/L的母液，5～7 ℃下放置备用。

1.3试验方法

1.3.1形态与分子生物学鉴定。

取寄生虫活体将其置于培养皿中，在蔡司体视显微镜（BHCS-LT004）下观察，进行拍照和测量，并描述其外部形态特征。使用动物基因组 DNA 抽提试剂盒提取寄生虫DNA，查阅文献设计下列引物扩增其COI序列［3］。

F1为5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，R1为5′-TAAACTTCAGGGTGACCCAAAAAATCA-3′。

25 μL 反应体系：ddH2O 12 μL，Taq 酶10 μL，正、反向引物和模板DNA各1 μL。PCR反应程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。

PCR 扩增完成后，取 5 μL PCR扩增产物使用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果通过NCBI网站在线Blast数据库进行序列同源性比较，并通过Mega 4.0软件构建系统发育树。

1.3.2离体条件下药物对中华湖蛭成虫的杀灭效果试验。根据预试验结果，每种药物配制5个药物浓度梯度［4］（表1）置于烧杯中，每个试验烧杯中分别放入中华湖蛭10条，每组设3个重复。药物浸浴1 h后，观察并记录中华湖蛭死亡情况，死亡判断标准为中华湖蛭身体伸长、针刺无反应。

1.3.3在体条件下药物对中华湖蛭成虫的杀灭效果试验。

根据离体试验结果，选择生石灰、川楝子和敌百虫对已感染中华湖蛭的鲢鱼进行在体试验。药物浓度同表1，养殖桶试验水体300 L，并在每个桶内放养3尾鲢鱼，每组设3个重复。将鲢鱼在药物中浸浴1 h后捞至清水养殖桶内继续观察，试验期间若出现鱼体体色变淡，应迅速中断试验，将其捞至清水养殖桶内，试验24 h后再对鱼体寄生的虫体情况进行检查并记录。

1.4数据统计与分析

试验数据均使用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行统计分析，并使用Origin软件绘图。

2结果与分析

2.1形态特征及鉴定

此次发现寄生在鳙、鲢鱼鳃上的虫体呈长椭圆形，背面隆起，腹面平坦。体长25～60 mm，体宽8～22 mm，头部呈横卵圆形，躯干部宽而长，略呈长卵圆形，中部最宽阔。颈部狭且短。背面深褐色，腹面灰白色，前、尾两吸盘和颈部均呈米黄色，尾吸盘部位呈深杯状，腹部两侧有膜质的搏动囊11对，能有节律地搏动，除第1对较小外，其余10对均较大，主要寄生在鲢和鳙鱼鳃弓上以及鳃丝基部或鳃瓣之间（图1）。这与《中国动物志：环节动物门 蛭纲》［5］

所描述的中华湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）的形态特征相吻合。根据线粒体基因COI进行系统发育树构建，发现寄生虫JH20200616与Limnotrachelobdella sinensis（LC275140.1）聚为一支（图2），因此根据形态学与分子生物学数据确定为中华湖蛭。

2.2离体条件下药物对中华湖蛭的杀灭效果

选择4种常用渔药进行离体条件下对中华湖蛭的杀灭效果试验。结果表明，生石灰200.00 mg/L、川楝子400.00 mg/L、敌百虫4.00 mg/L浸浴1 h可以全部杀灭中华湖蛭（图3）。硫酸铜浓度高达200.00 mg/L也只能使60%的中华湖蛭死亡，杀灭效果不理想。

2.3在体条件下药物对中华湖蛭的杀灭效果

在体条件下将感染中华湖蛭的鲢鱼进行不同浓度药物浸浴，1 h后捞至清水中暂养24 h进行观察。经观察发现，浓度25.00和50.00 mg/L川楝子浸浴1 h的杀灭效果较差，24 h后观察发现虫体仍比较活跃；浓度100.00和200.00 mg/L川楝子浸浴后，24 h观察发现虫体大部分脱落死亡，但仍有少量虫体存活；浓度400.00 mg/L川楝子浸浴24 h后虫体全部死亡脱落，在此期间鲢鱼活动正常，未见不良反应。

0.25和0.50 mg/L敌百虫浸浴1 h对中华湖蛭的杀灭效果较差，24 h后观察发现虫体仍比较活跃；1.00 mg/L敌百虫浸浴后，24 h观察发现虫体有少量脱落，仍有少量虫体存活；2.00 mg/L敌百虫浸浴1 h可以有效抑制中华湖蛭的活性，且鲢鱼活动正常，捞至清水中24 h后虫体全部死亡脱落；4.00 mg/L敌百虫浸浴20 min后鲢鱼出现不适反应，主要表现为体色变淡发白，迅速捞至清水中后很快恢复正常，24 h后检查发现虫体已全部死亡脱落。