高粱镉胁迫响应基因sbbHLH168的表达特征及生物信息学分析

摘要［目的］以高梁基因sbbHLH168为研究对象，探究其耐镉胁迫发热分子机制，对培育耐镉高粱提供了理论参考。［方法］从高粱品种“BTx623”镉胁迫下转录组数据（RNA-seq）中筛选出一个受镉胁迫后显著上调表达的基因sbbHLH168，使用在线软件对其生物信息进行分析；通过洋葱表皮侵染进行亚细胞定位；构建pGBKT7-sbbHLH168载体验证sbbHLH168基因的转录激活活性；将水培至四叶一心的高粱置于NaCl、PEG、ABA、ACC、GA和JA溶液处理，分别在0、1、12、24和48 h提取RNA，通过RT-qPCR检测sbbHLH168基因的相对表达量。［结果］sbbHLH168基因的开放阅读框长度为567 bp，编码189个氨基酸残基，蛋白分子量为20.55 kD，理论等电点（PI）为8.86，为碱性带正电的蛋白，定位于细胞核，具有较强的转录激活活性。sbbHLH168基因在盐、干旱和植物激素胁迫下表达量整体呈上升趋势，但表达量在不同处理时间存在明显差异。对sbbHLH168基因在不同组织中的表达发现，该基因在高粱的根和叶中均有表达，其中在盐、干旱、ABA、GA和JA胁迫下，sbbHLH168基因在处理12 h时表达量最高。而在ACC处理时，则在处理24 h时表达量最高。［结论］sbbHLH168基因是一个定位在细胞核有转录激活活性的转录因子，属于bHLH家族。

关键词高粱；sbbHLH168；生物信息学分析；表达特征；转录激活活性

中图分类号Q 81文献标识码A文章编号0517-6611（2023）24-0086-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.019

Expression and Bioinformatics Analysis of Cadmium Stress Response Gene sbbHLH168 in Sorghum bicolor

YU Wenhui1， ZHENG Jia2， LI Yanghua2 et al

（1.College of Bioengineering，Sichuan University of Science & Engineering，Yibin，Sichuan 644000;2. Wuliangye Group Co.， Ltd.， Yibin， Sichuan 644000）

Abstract［ Objective ］The study aimed to explore the molecular mechanism of cadmium stress tolerance in Sorghum bicolor gene sbbHLH168， which plays an important role in plant response to biotic and abiotic stresses， it provides a theoretical reference for breeding cadmiumtolerant Sorghum bicolor. ［Method］A significantly upregulated sbbHLH168 was screened from the transcriptome data （RNAseq） of Sorghum bicolor cultivar ‘BTx623’ under cadmium stress， and its biological information was analyzed by online software subcellular localization of sbbHLH168 gene was carried out by infection of onion epidermis， PGBKT7sbbHLH168 vector was constructed to verify the transcriptional activation activity of sbbHLH168 gene， and Sorghum bicolor plants cultured in water were treated with NaCl， PEG， ABA， ACC， GA and JA solutions， RNA was extracted at 0，1，12，24 and 48 hours respectively， and the relative expression of sbbHLH168 gene was detected by RTqPCR. ［Result］The open reading frame length of sbbHLH168 gene was 567 bp， encoding 189 amino acid residues. The molecular weight of sbbHLH168 protein was 20.55 kDa， and the theoretical isoelectric point （PI） was 8.86. sbbHLH168 was a basic protein with positive charge， which was located in the nucleus of cells， it has strong transcriptional activation activity. The expression level of sbbHLH168 was increased under salt， drought and plant hormone stress， but the expression level was significantly different at different treatment time. The expression of sbbHLH168 gene in different tissues showed that sbbHLH168 gene was expressed in root and leaf of Sorghum bicolor， and the highest expression level was observed under salt， drought， ABA， GA and JA stress for 12 h. In ACC treatment， the highest expression level was observed at 24 h. ［Conclusion］sbbHLH168 gene is a transcription factor with transcriptional activation activity located in the nucleus and belongs to bHLH family.

Key wordsSorghum bicolor;sbbHLH168;Bioinformatics analysis;Expression characteristics;Transcriptional activation activity

高粱［Sorghum bicolor（L.） Moench］属于禾本科单子叶植物，具有较强的耐盐碱、耐高温和抗旱等抗逆特性。高粱的生产和生物量相较于其他粮食作物更高，因此是许多非洲和许多发展中国家的重要食物来源［1］。近年来，高粱受到真菌、重金属、低温、干旱等逆境胁迫的影响，严重影响高粱的产量和品质［2］。其中，镉是植物生长发育的一种非必需元素，它很容易被根吸收，并通过木质部运输到叶中。植物内镉的积累会引起各种毒性症状，例如叶片变黄、萎蔫、生物量减少和细胞死亡等［3］。因此，对高粱抗逆胁迫基因进行研究具有重要意义。

自然界的植物在生长发育过程中不可避免地会受到许多生物和非生物胁迫的影响［4］。为了生存，植物本身必须利用广泛的生理生化过程来应对各种压力［5］，这些反应通过激活或抑制基因特异性表达来进行调节［6］。基因特异性表达途径之一是转录因子与顺式元件的相互作用，特异性表达与环境胁迫有关的基因，以维持植物的正常生命活动［7］。转录因子（transcription factor，TF）又称反式作用因子，其主要功能是激活或抑制基因的转录效应。通过转录因子的调控作用，可以利用转录因子来改良植物的抗逆性［8］。根据其DNA保守结构域的不同，可以分为AP2/EREBP、MADS、bZIP和MYB等若干个家族［9］，在与植物抗逆性相关的转录因子家族中，bHLH家族是植物中仅次于MYB家族的第二大家族［10］，它是由bHLH特征结构域定义的DNA结合蛋白超家族，该结构域包含参与DNA结合的基本区域和HLH区域充当的二聚结构域［11］。随着分子生物学的发展和基因组序列的增加，越来越多的bHLH转录因子被鉴定出来。例如，花生（Arachis hypogaea Linn.）、短柄草［Brachypodium sylvaticum（Huds.） Beauv.］、苹果（Malus pumila Mill.）和大豆［Glycine max（Linn.） Merr.］的基因组分别包含261、146、188和155个bHLH基因［9，12-13］。植物bHLH转录因子调节大量基因的表达，涉及广泛的调节途径［14］，如植物次生代谢：水稻（Oryza sativa L.）bHLH家族成员OsbHLH148被证明通过调节茉莉酸信号参与介导耐寒性［15］。bHLH112增加了拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞的ABA 水平。拟南芥AtbHLH40则与赤霉素的合成转导有关［16］。响应逆境胁迫：如AtbHLH12基因可以正向调控拟南芥对盐、干旱及渗透胁迫的抵抗力［17］；IbHLH1在苹果对冷胁迫的适应中发挥重要作用［18］。控制细胞的生长：如水稻的稀穗突变体LAX是控制植株顶端分生组织的主要调节因子［19］。拟南芥SPATULA基因参与花形态建成和角果发育等多种发育过程［20］。AtbHLH95基因通过控制胚胎发育延缓植物的生长［21］；拟南芥的AtbHLH21和水稻的OsbHLH164对花粉粒的形成及绒毡层细胞的发育有着关键的调控作用［22］。这些结果表明，bHLH转录因子除了调节植物生长发育之外，还在植物应对各种非生物胁迫中起着关键作用。已知的植物bHLH基因序列主要来源于水稻和拟南芥2种模式植物，对其他植物bHLH蛋白的功能研究还比较少［23］。

笔者从高粱镉胁迫下的转录组数据中筛选出一个显著上调表达的基因sbbHLH168。通过生物信息学等方法分析该基因的基本特征，并通过实时荧光定量PCR（quantitative real．time PCR，RT-qPCR）检测sbbHLH168基因在不同非生物胁迫处理下在高粱根和叶中的相对表达量，了解其在抗逆胁迫中的作用，以期为sbbHLH168基因的研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料及主要试剂

试验材料包括实验室提供的高粱品种“BTx623”和P30-GFP载体，以及市场上购买的洋葱（Allium cepa L.）。试验所用试剂包括TRIzol试剂和DNA Maker DL 2000购自天根生化科技（TIANGEN）有限公司；PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ购于宝日医（北京）生物技术有限公司，2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金（TransGen Biotech）生物技术有限公司。试验所用设备为Genesy 96T基因扩增热循环仪（西安天隆科技有限公司），TG16高速离心机（四川蜀科仪器有限公司），EF-UPR激光共聚焦显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），Nano Drop 2000分光光度计（Thermo Scientific，美国），凝胶成像系统（Bio-Rad，美国），RQH智能人工气候培养箱（郑州生元仪器有限公司），CFX96 Real-Time PCR System定量荧光PCR仪（Bio-Rad，美国），JY300E电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1多种非生物胁迫处理。

将高粱种子置于水培盒中培养至四叶一心时进行盐胁迫（100 mmol/L NaCl）和干旱胁迫（20% PEG 2 000）以及100 μmol/L ABA（脱落酸）、100 μmol/L ACC（乙烯合成前体）、100 μmol/L GA（赤霉素）和100 μmol/L JA（茉莉酸）处理。并在处理后的0（CK）、1、12、24和48 h分别取其根和叶组织样品，置于液氮中速冻，剩余样品于-80 ℃冰箱保存备用。每组试验设置3次生物学重复［24］。