UdhA和博伊丁假丝酵母xylI基因共表达对木糖醇发酵的影响

摘要 [目的]研究可溶性吡啶核苷酸转氢酶基因（UdhA）和醛糖还原酶基因（xylI）共表达对木糖醇发酵的影响。[方法]将来源于博伊丁假丝酵母醛糖还原酶xylI基因克隆到pET28a（+）上，并在BL21（DE3）中表达，通过SDS-PAGE对表达产物的分子量和酶活进行测定。随即将xylI基因连接lacP启动子，构建pWYZ-2质粒并将其转化到E.coli AI07菌株。进一步将来源于E.coli W3110的UdhA基因克隆到pWYZ-2质粒实现与xylI共表达，所构建pWYZ-4质粒转化到E.coli AI07菌株，比较了E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4木糖醇发酵结果。[结果]在BL21（DE3）/pET28a（+）体系诱导表达的醛糖还原酶分子量为39  kD，木糖还原酶酶活为3.30 U/mL。E.coli AI07/pWYZ-2菌株发酵48 h，木糖醇产量为19.90 g/L;E.coli AI07/pWYZ-4发酵36 h，木糖醇产量达到19.91 g/L，较菌株AI07/pWYZ-2生产强度提高了33.25%。[结论]通过将UdhA基因与xylI 基因进行共表达，提高了重组大肠杆菌（E.coli AI07/ pWYZ-4）合成木糖醇的生产强度。

关键词 博伊丁假丝酵母;xylI基因;UdhA基因;共表达;木糖醇

中图分类号 Q 812  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0106-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.027

The Effect of Co-expression of UdhA and Candida boidinii xylI Gene on Xylitol Fermentation

TANG Mei， CAI Song， FU Sheng-liang et al

（Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology， Hubei University of Technology， Wuhan， Hubei 430068）

Abstract [Objective] The effect of co-expression of soluble pyridine nucleotide transhydrogenase gene （UdhA） and aldose reductase gene （xylI） on xylitol fermentation was investigated. [Method] xylI gene from Candida boidinii encoding aldose reductase was cloned into pET28a（+） and expressed in BL21（DE3）. The enzyme molecular weight was detected by SDS-PAGE and enzyme activity was assayed. xylI gene was ligated to the lacP promoter for construction of plasmid pWYZ-2 and then the plasmid was transformed into E.coli AI07.The UdhA gene derived from E.coli W3110 was further cloned into pWYZ-2 plasmid to achieve co-expression with xylI for pWYZ-4 plasmid construction and then pWYZ-4 was transformed into E.coli AI07. E.coli AI07/pWYZ-2 was compared with E.coli AI07/pWYZ-4 for xylitol fermentation.[Result] The molecular weight of xylose reductase expressed in BL21（DE3）/pET28a（+） system was 39 kD， and the enzymatic activity of aldose reductase was 3.3 U/mL.The E.coli AI07/pWYZ-2 strain was fermented for 48 hours， the xylitol output was 19.90 g/L. E.coli AI07/pWYZ-4 was fermented for 36 hours， xylitol production reached 19.91 g/L， xylitol productivity of E.coli AI07/pWYZ-4 was 33.25% higher than that of strain E.coli AI07/pWYZ-2.[Conclusion]Xylitol productivity of recombinant Escherichia coli was improved using co-expression of UdhA gene and xylI gene.

Key words Candida boydingii;xylI gene;UdhA gene;Co-expression;Xylitol

基金项目 国家“十二五”支撑计划项目（2012BAD27B03）;山东创新计划项目（201720311004）。

作者简介 唐梅（1993—），女，湖北广水人，硕士，从事代谢工程及发酵技术研究。通信作者，副教授，从事生物能源与生物材料研究。

收稿日期 2021-04-22

木糖醇广泛存在于各种果蔬食物中，含量却很低[1]，其应用范围广，且由于木糖醇在人体内的代谢与胰岛素无关[2-3]，故适用于生产糖尿病患者食品。近年来，木糖醇的市场需求不断扩大，国内木糖醇年产值已超过13亿元，预计今后国际市场上木糖醇总需求量将达10万t以上[4]。

通过微生物发酵或者催化获得木糖醇正成为木糖醇合成的热点，醛糖还原酶（也称为木糖还原酶）作为生物合成法中的关键因子，主要存在于酵母和丝状真菌中[4]。目前发现的醛糖还原酶都需要辅酶，其中一类是辅酶NADH依赖型，如来源于近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）[5]的木糖还原酶;另外一类是辅酶NADPH依赖型，如来源于热带假丝酵母（Candida boydingii）[6]、埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）[7]和博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）等[8]微生物的醛糖还原酶。对于辅酶NADPH依赖型的木糖还原酶，要提高木糖醇的产量，需要更多的NADPH来满足酶催化的需要。

通常通过表达磷酸戊糖途径的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gnd来强化NADPH的产出[9];也有敲除EMP途径中编码磷酸果糖激酶的pfkA和pfkB基因，使碳源更多地流向磷酸戊糖途径，从而实现NADPH的供给[10]。

可溶性吡啶核苷酸转氢酶能催化NADH和NADPH相互转化[11]，改变了细胞内NADH/NAD+的比例。考虑到糖酵解途径不依赖氧气也能产生大量的NADH，如果将这部分辅因子转化成NADPH形式，将为NADPH的供给提供一个新的途径。在前期产丙酮酸大肠杆菌工程菌构建的工作中，成功将大肠杆菌W3110自身的UdhA基因克隆到载体上，通过诱导表达发现，UdhA的克隆有效地促进了丙酮酸发酵的生产强度[12]。

考虑到博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）在木糖醇合成中也存在辅酶NADPH依赖的难题，笔者借鉴丙酮酸工程菌构建的结果，将博伊丁假丝酵母的醛糖还原酶基因xylI进行克隆、表达及酶活测定，并探讨可溶性吡啶核苷酸转氢酶UdhA和xylI共表达对木糖醇发酵的影响，以期为解决NADPH依赖型醛糖还原酶辅因子不足的问题提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒。所用菌株和质粒见表1。

1.1.2 引物。

引物序列见表2，均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要试剂与仪器。

主要试剂：木糖醇对照品（含量>99.9%），2×Taq polymerase，PrimerSTAR Max DNA Polymerase，其他试剂均为市售分析纯;主要仪器：e2695液相色谱、蛋白电泳仪、凝胶自动成像仪、PCR仪、电转仪。

1.1.4 培养基。

LB液体培养基：酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L。

抗性平板培养基：酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂粉20 g/L，根据用途加入50 mg/L氨苄青霉素或者卡那霉素。

摇瓶种子培养基：葡萄糖20 g/L、木糖1 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L、氨苄青霉素50 mg/L。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖20 g/L、木糖20 g/L、酵母粉5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 将xylI基因克隆到载体pET28a（+）。

（1）以质粒pAGI02作为模板，采用引物pET28a（+）-xylI（AR）-p1和pET28a（+）-xylI（AR）-p2扩增出理论长度为1 016 bp的xylI核酸序列。

（2）以pET28a（+）作为模版，采用反向引物pET28a（+）-p-F-P1和pET28a（+）-p-F-P2将pET28a（+）线性化，得到理论长度为5 000 bp的核酸序列。

（3）采用T5外切酶[13]的方法处理xylI核酸序列和pET28a（+）线性化的核酸序列，处理后的产物用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，30 ℃ 150 r/min复苏40 min后取100 μL菌液涂布于卡那抗性平板上，待卡那抗性平板上长出单菌落后，挑取单菌落提取重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司测序，将测序无误的重组质粒命名为pET28a（+）-xylI。

（4）将重组质粒pET28a（+）-xylI采用氯化钙法转化到E.coli BL21中，得到菌株BL21/pET28a（+）-xylI。

1.2.2 将xylI基因克隆到载体pBR322。

（1）以质粒pBR322作为模版，采用反向引物pBR322-F-P1和pBR322-F-P2将pBR322线性化（线性化序列为除去tetP和Tcr部分的序列），得到理论长度为3 094 bp的核酸序列。

（2）以pWYZ-1质粒作为模版，设计引物pBR322-lacP-xylI P1和pBR322-lacP-xylI P2，从pWYZ-1质粒上扩增出lacP-xylI核酸序列，大小为1 168 bp。

（3）用T5外切酶的方法[13]处理lacP-xylI核酸序列和pBR322载体线性化的核酸序列，处理后的产物用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，30 ℃150 r/min复苏40 min后取100 μL菌液涂布于氨苄抗性平板上，待氨苄抗性平板上长出单菌落后，挑取单菌落提取重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司测序，将测序无误的重组质粒命名为pWYZ-2。