黑豆异黄酮的提取分离及其对DPPH自由基的清除能力

摘要 基于超声时间、液料比和超声温度的单因素试验，通过响应面分析法优化，结合样品粉末的SEM表征，确定超声辅助法提取黑豆异黄酮的最优工艺条件;经大孔树脂（D-101）纯化黑豆异黄酮粗提物，继而以乙酸乙酯-甲醇（V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1）溶液洗脱过硅胶层析柱，得组分Ⅰ和组分Ⅱ;考察异黄酮、组分Ⅰ和组分Ⅱ体外抗氧化活性。结果表明：超声辅助法提取黑豆异黄酮的最优工艺参数为时间38 min，液料比32∶1，温度53 ℃，该条件下黑豆异黄酮提取量[（9.403±0.698） mg/g]最大;经大孔树脂（D-101）纯化得到纯度较高（异黄酮含量[（53.37±3.37）%]的异黄酮;过硅胶层析柱得组分Ⅰ和组分Ⅱ。当总异黄酮、组分Ⅰ和组分Ⅱ的浓度达到0.25 mg/mL时，DPPH·自由基清除率分别达到了（71.28±1.41）%、（34.60±2.95）%和（42.01±1.34）%，总异黄酮的清除率是组分Ⅰ和组分Ⅱ的2.06和1.70倍，总异黄酮、组分Ⅰ和组分Ⅱ的抗氧化能力依次为总异黄酮>组分Ⅱ>组分Ⅰ。

关键词 响应面法;异黄酮;分离纯化;抗氧化活性

中图分类号 TQ 914.1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0171-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.046

开放科学（资源服务）标识码（OSⅠD）：

Extraction of Isoflavones from Glycine max and Its Ability to Scavenge DPPH Free Radicals

WANG Ning， ZHANG Ye-tao， LU Xiao-fang

（Foundation Department， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract The optimal process conditions for ultrasonic-assisted extraction of isoflavones from Glycine max were determined based on univariate analysis of ultrasonic time， solid-liquid ratio and ultrasonic temperature， and SEM characterization of sample powder. After purifying the crude extract of isoflavones from Glycine max by the macroporous resin （D-101）， and silicagel column chromatographic separation in ethyl acetate-methanol （Vethyl acetate∶Vmethanol=10∶1）， component I and component II were obtained. The in vitro anti-oxidant activities of isoflavones， component I and component II were analyzed. The results showed that the optimal process parameters for the extraction of isoflavones from Glycine max  by the ultrasonic-assisted method were as follows： time， 38 min;liquid-solid ratio，32∶1;temperature， 53 ℃. Under these conditions， the extraction rate of isoflavones from Glycine max  achieved the highest （9.403±0.698）mg/g. Using the macroporous resin （D-101）， highly purified isoflavones were extracted from Glycine max  （53.37±3.37）%. Component I and component II were obtained from the silicagel column chromatographic separation. Under the concentrations of total isoflavones， component I and component II at 0.25 mg/mL， their DPPH free radical scavenging rate reached （71.28±1.41）%， （34.60±2.95）% and （42.01±1.34）%， respectively. In particular， the scavenging rate of total isoflavones was 2.06 and 1.70 times than that of component I and component II. The antioxidant capacity remained highest in total isoflavones， followed by component II， and component I.

Key words The response surface method;Isoflavones;Separation and purification;Antioxidant activity

基金项目 山西省高等学校大学生创新创业训练项目（202010113014）;山西农业大学博科研启动（J242098140）。

作者简介 王宁（1999—），男，山东临沂人，从事植物活性成分提取及活性研究。通信作者，副教授，博士，从事天然产物提取及活性研究。

收稿日期 2021-06-02

黑豆属于豆科大豆属植物，具有很强的环境适应能力，在气温较为寒冷、雨水量较少的北方有着广阔的种植面积[1-3]。作为具有预防和治疗多种疾病的食药同源物种之一的黑豆异黄酮含量较高[4]，因此其具有预防心血管疾病、治疗糖尿病、抗炎症、改善骨质疏松、降低乳腺癌的发病几率等功效[5-8]。目前，超声辅助提取天然产物大大提高了活性组分的溶出率[9]。因此，该研究采用响应面法优化黑豆异黄酮超声提取工艺，并经大孔树脂和硅胶柱分离纯化[10]，研究黑豆异黄酮最优提取分离方法，测定其体外抗氧活化活性[11]，以期为黑豆相关附加产品、功能食品等在临床医学、制药、化妆品、保健等方面的开发和推广使用提供参考和理论依据[8]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 武乡黑豆，由山西农业大学大豆课题组提供。

染料木素标准品（纯度98%），成都植标化纯生物技术有限公司;石油醚（分析纯），天津市大茂化学试剂厂;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（分析纯，DPPH） ，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司;抗坏血酸（分析纯），中国医药公司北京采购供应站;无水乙醇（分析纯），天津市天大化工试验厂。

1.2 仪器与设备

UV1100紫外分光光度计，长沙科美分析仪器有限公司;YRE2000E旋转蒸发仪，巩义市予华仪器责任有限公司;GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司;KM-300DE中文液晶台式超声波清洗器，昆山美美超声仪器有限公司;SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵，郑州予华仪器制造有限公司;DL-0506低温冷却液循环泵，河南兄弟设备仪器有限公司。

1.3 标准曲线的绘制

准确称取22.4 mg染料木素标准品溶于70% （V/V）乙醇溶液，定容至100 mL，分别吸取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 mL染料木素溶液，置于100 mL容量瓶中定容，即得不同浓度梯度的染料木素标准溶液。利用紫外分光光度计对染料木素标准溶液于200～600 nm处扫描，确定最大吸收波长，即含量检测波长。以不加样品的平行样作为空白对照，在最大的吸收波长处测定吸光度。以70%乙醇为空白对照，吸光度为纵坐标，标准品质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程（n=3）。

1.4 黑豆异黄酮的提取 黑豆异黄酮提取流程如图1所示，每组3次平行。按“1.3”中的方法测定溶液吸光度，根据回归方程计算黑豆异黄酮提取量。

黑豆异黄酮的提取量（mg/g）=C·V·n/m（1）

式中，C为黑豆异黄酮的质量浓度（mg/mL）;V为定容体积（mL）;n为稀释倍数;m为原料质量（g）。

1.5 单因素试验

1.5.1 超声时间对黑豆异黄酮提取量的影响。

准确称取脱脂黑豆粉末10 g，液料比40∶1（mL∶g），提取液为70%乙醇溶液，超声波功率270 W，温度60 ℃，分别设定超声时间为10、20、30、40、50和60 min。按“1.4”中方法计算黑豆异黄酮提取量。

1.5.2 超声温度对黑豆异黄酮提取量的影响。

准确称取脱脂黑豆粉末10 g，液料比40∶1，超声时间30 min，超声功率270 W，提取液为70%乙醇溶液，超声温度分别为25、40、50、60和70 ℃。按“1.4”中方法计算黑豆异黄酮提取量。

1.5.3 液料比对黑豆异黄酮提取量的影响。

准确称取脱脂黑豆粉末10 g，超声温度为 60 ℃，超声功率为 270 W，超声时间30 min，提取液为70%乙醇溶液，液料比分别为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50。按“1.4”中方法计算黑豆异黄酮提取量。

1.6 响应面法优化黑豆异黄酮提取工艺

以超声时间（A）、液料比（B）和超声温度（C）3个条件为自变量因素，基于黑豆异黄酮超声提取单因素试验结果，设计响应面优化试验（表1），通过 Design Expert 12.0软件对试验结果进行回归分析，得到黑豆异黄酮最优提取工艺条件。

1.7 粉末SEM表征

扫描电子显微镜（VEGA Ⅱ RSU型，TESCAN公司），用于分析和描述黑豆细胞壁结构在不同条件（超声时间、液料比、超声温度）下提取前后的变化[12]。

1.8 TLC法检测黑豆异黄酮苷元

采用薄层层析法对黑豆异黄酮苷元进行初步分离检测。将薄层层析板切成高5 cm、宽1 cm 的板，在距下缘0.5 cm处点样（点样量约10 μL，点样直径≤2 mm），吹风机吹干。将薄板放入展开剂饱和后的层析缸中展开，展开剂为V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1，展开后吹干，紫外线波长 254 nm 处[13]检测黑豆异黄酮苷元斑点。

1.9 黑豆异黄酮的分离纯化 ①大孔吸附树脂预处理。将D101大孔树脂浸泡于体积分数为95%乙醇溶液中24 h，然后用蒸馏水洗涤至中性;再分别用体积分数为5% NaOH溶液浸泡12 h，洗涤至中性;最后用体积分数为5% HCl浸泡12 h，洗涤至中性，静置待用。

②将活化后的大孔树脂装柱，取质量浓度为2 mg/mL黑豆异黄酮粗提取液上样，先用蒸馏水冲洗，去除水溶性杂质，再用70%乙醇溶液洗脱，选用薄层色谱分析法跟踪检测，收集含黑豆异黄酮流出液。③活化后的硅胶粉干法装柱。将硅胶直接装入柱中，轻敲硅胶柱两侧，当硅胶高度到达合适位置后用泵将填料压实。将大孔树脂纯化后的黑豆异黄酮样品干法上样，以V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1为洗脱剂进行洗脱。