玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的测定能力验证

摘要 [目的]通过实验室能力验证活动分析了影响玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）检测结果的主要因素。[方法]依据GB 5009.111—2016第二法：免疫亲和层析净化HPLC法检验并优化前处理条件。[结果]采用5倍稀释浓度提取1 h和3 mL/min的净化速度，能力验证样品中DON含量为571 μg/kg，RSD为0.25%。[结论]通过了中国食品药品检定研究院组织实施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》能力验证，与中国食品药品检定研究院统计Z比分值为0.70，能力验证结果为满意，细化完善了国标测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的操作，为广大检验检测人员提供参考。

关键词 脱氧雪腐镰刀菌烯醇;能力验证;玉米粉;高效液相色谱法

中图分类号 TS 201.6  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0177-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.047

Proficiency Testing for Determination of Deoxynivalenol in Corn Flour

WANG Bei-bei1，2， ZHU Lian-xu3， LI Chong-yong1 et al

（1. Hanzhong Testing and Inspection Center for Food and Drug Control， Hanzhong， Shaanxi 723000;2. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000;3. Zhenba County Market Supervision Administration， Zhenba， Shaanxi 723600）

Key words [Objective]Through a laboratory proficiency testing activity， the main factors affecting the detection results of deoxynivalenol in corn flour were analyzed. [Method]According to the second method of the national standard GB5009.111-2016 to check and optimize the pretreatment conditions.[Result]

Under the conditions of extraction at 5 times of dilution concentration for 1 h and 3 mL/L flow rate， the DON content in the ability verification sample was 571 μg/kg， RSD was 0.25%.

[Conclusion]Passed the NIFDC-PT-228 “Deoxynivalenol Determination of Deoxynivalenol in Corn Flour” proficiency test organized and implemented by the China Institute for Food and Drug Control， and the Z score with the organizer was 0.70. The proficiency test results were satisfactory， and the national standard determination of deoxynivalenol has been refined and perfected to provide a reference for the majority of inspection and testing personnel.

Key words Deoxynivalenol;Proficiency testing;Corn flour;High performance liquid chromatography

基金项目 汉中市地产食品质量监控与品质提升创新团队基金项目（201902）。

作者简介 王蓓蓓（1984—），女，陕西榆林人，硕士，从事食品检验检测与质量控制研究。

通信作者，高级工程师，从事食品药品质量安全控制、生产工艺与检验检测研究。

收稿日期 2021-04-25

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又称呕吐毒素，是一种主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素，也是粮食中重要的食品安全指标。人和动物食用了被 DON 污染的食物后，会产生厌食、呕吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，严重会导致死亡[1]。DON化学性质较稳定，玉米、小麦、大麦等谷物及其加工产中广泛存在[2]。近年来，我国谷物受到DON污染日益严重，尤其是小麦粉及其制品、玉米等。从含量上看，小麦粉制品中，饼干中DON的污染状况较重，而玉米由于生长期较长且正值雨季，更易被镰刀菌污染，是目前污染最严重的谷物之一[3-4]。我国是玉米生产大国，玉米不仅是食品原料，也是饲料原料，饲料通过肉、蛋、奶等食物链最终影响人类营养和健康，因此其安全影响巨大[5]。在潮湿、温热等气候条件下，更易产生DON毒素，并经由谷物或饲料通过食物链传递富集至人体内，给世界粮食产业形成庞大的经济损失[6]。据世界卫生组织、欧洲食品安全局等机构的广泛调查评估，过去10年，原粮中的DON感染率达58%，将DON列为最危险的食品污染物之一，美国、日本、欧盟等地区和国家已经就食品中的真菌毒素含量作出严格规定[7-8]。

国家农业、粮食、市场监管等部门为了更加准确地把握谷物粮食中的 DON污染状况，每年都在全国开展各类粮食产品中DON的监督抽查和风险监测，且在GB 2761—2017中对食品中DON采取了严格的限量标准：玉米、玉米面的DON 含量≤1 000 μg/kg;大麦、小麦、麦片、小麦粉的DON含量≤1 000 μg/kg[9]。目前，对于DON的检测有高效液相色谱法、高效液相-串联质谱法、薄层色谱法、酶联免疫法和生物芯片技术，通过持续开展检测评价，逐步提升实验室毒素检验检测能力，对于评估我国粮食毒素污染程度，保障粮食安全有着至关重要的意义[5，10]。因此，准确评价谷物制品中DON含量是现阶段食品和粮食安全的必然要求。

为了切实提升实验室的检验能力和人员的技术水平，2019年参加了中国食品药品检定研究院组织实施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》能力验证，样品编号TF228-0054，笔者在查阅相关文献[11-17]和结合自身实验室条件下，按照GB 5009.111—2016第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法[18]，剖析了各环节中可能影响玉米粉中DON含量测定结果的要点，并对前处理的条件进行了优化，为今后相关检测检验提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米粉（编号：TF228-0148），中国食品药品检定研究院提供。DON标准溶液：100.10 μg/mL（Rome labs Lot# L18492D）。玉米粉中DON质控样：（569±60） μg/kg（Rome labs Lot# M15361D）。

分析天平（日本岛津d=0.01 g）;氮吹仪（睿科科技有限公司）;水浴恒温振荡器（常州亿能实验仪器厂）;高效液相色谱仪（日本岛津LC-20AD）;C18色谱柱（月旭科技有限公司4.6 mm×250 mm，5 μm）;DON免疫亲和柱3 mL（Rome labs）;Milli-Q纯水机（美国密理博公司）。

甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技中国公司）;氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾（分析纯，成都科龙化学用品有限公司）;试验用水：符合GB/T 6682—2016《分析实验室用水规格和试验方法》一级水的要求。

1.2 方法

参考GB5009.111—2016第二法免疫亲和层析净化HPLC法进行试验[19]。统计方法用SPSS进行统计分析，差异性检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.1 样品的制备。

该试验能力验证样品为玉米粉，样品用铝塑袋真空包装，每瓶装量约30 g，常温避光保存[10]。能力验证作业指导书要求一次取样量不少于5 g，样品称量前稳定至室温（20～25 ℃）。

1.2.2 样品的提取。

提取溶剂主要为超纯水，提取方式为超声波或者摇床振摇，该环节主要研究样品稀释倍数、提取时间对结果的影响。该试验分别对质控样品稀释3、5、8倍，摇床振摇时间分别为0.5、1.0、2.0 h。

1.2.3 样品的富集净化。

研究净化液过免疫亲和柱时流速对结果的影响，分别对质控样净化液采取1、3、6 mL/min的速度进行净化分析。

1.2.4 液相色谱条件。

流动相：甲醇-超纯水（20∶80，V/V）;进样量：50 μL;检测波长：218 nm;流速：1 mL/min;柱温：35 ℃;色谱柱：月旭C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准物质选用Rome labs的有证标准物质，赵晶晶等[19]通过用超高效液相色谱法测定了玉米中DON含量，剖析了不确定度各因素的影响后得出，质量浓度、测量重复性、体积量取是影响测定结果不确定度的主要因素。经过预试验以及加标浓度的考虑，选取100～1 000 ng/mL线性范围，使得待测样品浓度尽量在线性中间区域，在该线性范围内曲线方程为：y=59.56x+159.60，R2=0.999（图1、2）。标准储备溶液、标准点的稀释溶液应与流动相一致以降低溶剂效应，配置标准储备溶液与标准曲线选取应选用校准的移液管（移液枪）和容量瓶，尽量减少转移次数，将标曲配制及稀释过程带来的不确定度降至最低。

2.2 样品提取

分别对质控样品用水稀释3、5、8倍，摇床振摇0.5、1.0、2.0 h后，提取过滤净化，以3 mL/min的速度净化测定质控样品，结果见表1。由表1可知，振摇0.5 h稀释5倍和8倍结果差异不显著（P>0.05），稀释3倍和5倍结果差异显著（P<0.05）;振摇1.0 h和振摇2.0 h差异不显著（P>0.05），振摇1.0 h和振摇0.5 h差异显著（P<0.05）。结合试验提取效果和时间成本，避免由于稀释液不足及振摇时间短造成的提取不充分，以5倍稀释振摇1.0 h为最佳选择。

2.3 样品净化

由于玉米粉基质比较复杂，含有天然的色素、脂类、蛋白质等有机物质，对样品的检测干扰较大，为了降低基质的影响，用免疫亲和柱对提取液进行净化处理[10]。试验前需验证免疫亲和柱的柱容量，柱回收率是否满足要求。柱容量验证、柱回收率验证方法按照GB5009.111-2016附录A。5 mL超纯水中加入6 000 ng DON 标准储备溶液，混合均匀，分别取同一批次免疫亲和柱各3 根，每根免疫柱的上样量为1 mL，经过洗脱富集后用氮气吹干，流动相定容至1 mL，HPLC分离测定DON含量[9]。6支亲和柱的测定结果分别为1 120、1 135、1 080、1 050、1 103、1 060 ng，柱容量≥1 000 ng，柱回收率≥80%，为可使用商品。