差示苯酚-硫酸法结合DNS法测定红芪多糖（HPS）含量

摘要 [目的]优化建立差示苯酚-硫酸法结合DNS法测定红芪多糖含量的方法。[方法]采用单因素试验筛选考察差示苯酚-硫酸法的检测波长、显色剂用量、反应时间等条件;通过线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率分别对差示苯酚-硫酸法和DNS法进行方法学考察。[结果]差示苯酚-硫酸法测得的红芪样品中以葡萄糖计的总糖含量平均值为72.49%，DNS法测得样品中以葡萄糖计的还原性单糖含量平均值为8.13%，以葡萄糖计的多糖含量平均为64.36%，RSD均小于4%。[结论]该研究采用所建立的差示苯酚-硫酸法结合DNS法测定了红芪多糖的含量，结果显示此方法较准确稳定、重复性较好，在一定程度上减少游离还原糖及杂质的干扰，降低了由于操作等带来的系统误差，使样品中多糖含量的测定结果更接近真实值，为红芪多糖等中药多糖的含量测定提供更好的参考方法。

关键词 红芪多糖;差示苯酚-硫酸法;DNS法;含量测定

中图分类号 R 284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）04-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.048

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Differential Phenol-Sulfuric Acid Method Combined with DNS Method to Determine the Content of Hedysarum Polysaccharides （HPS）

ZHANG Xiao-rong1，2，HUANG Yu-fang1，2，3， HE Hai1，2 et al （1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000;2. Northwest Collaborative Innovation Center for Traditional Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000;3.Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province， Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000）

Abstract [Objective]To optimize the establishment of a differential phenol-sulfuric acid method combined with DNS method for the determination of HPS content. [Method]Single factor experiment was used to screen and investigate the detection wavelength， developer dosage， reaction time and other conditions of the differential phenol-sulfuric acid method; the differential phenol was determined by linear relationship， precision， stability， repeatability and sample recovery. Sulfuric acid method and DNS method for methodological investigation. [Result]The average total sugar content in the Hedysari radix sample measured by the differential phenol-sulfuric acid method was 72.49%， and the average reduction monosaccharide content in the sample measured by the DNS method was 8.13%， which was calculated as the glucose. The average content of polysaccharides was 64.36%， and the RSD was less than 4%. [Conclusion]The study uses the established differential phenol-sulfuric acid method combined with the DNS method to determine the HPS content. The results show that this method is more accurate， stable and has good repeatability. It reduces the interference of free reducing sugars and impurities to a certain extent， and reduces the system error caused by operation， etc.， makes the determination result of polysaccharide content in the sample closer to the true value， which will provide a better reference method for the determination of polysaccharide content in traditional Chinese medicine such as HPS.

Key words Hedysari polysaccharides （HPS）;Differential phenol-sulfuric acid method;DNS method;Content determination

基金项目 兰州市城关区科技计划项目（2020-2-2-2）;甘肃省科技厅自然科学基金项目（17JR5RA163）;甘肃省中药制药工艺工程研究中心开放课题（ZYGY202004）;中医药公共卫生服务补助专项子课题（2305191901）;甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放基金项目（ZDSYS-KJ-2018-005）。

作者简介 张小荣（1992—），女，甘肃庆阳人，硕士研究生，研究方向：中药药效物质基础与质量标准。*通信作者，博士，教授，硕士生导师，从事中药活性物质基础与质量控制研究。

收稿日期 2021-05-11

中药多糖作为天然产物，近年来在疾病预防及保健品开发方面有广阔的应用前景。但多糖分子量大、组成和结构复杂，且多糖的活性往往是由混合总糖共同作用的结果，又由于生长环境、制备工艺等不同，使中药多糖这一混合物不具备单体化合物那样准确的评价标准，其含量测定的方法和准确性也一直是个难题。

对于总糖的含量测定，现大多还是采用苯酚-硫酸[1-3]、蒽酮-硫酸、3，5-二硝基水杨酸（DNS）等传统比色法，其中最常用的是Dubois等[4-5]在1951年提出的苯酚-硫酸法，其操作简便、应用广泛。但传统苯酚-硫酸法不能排除样品中可直接与硫酸显色的非多糖杂质及还原性单糖的干扰，且反应温度、时间、试剂等条件对测定结果的稳定准确有影响。而贺福元等[6]提出的差示苯酚-硫酸法将苯酚和H2SO4先配制成显色液，以样品与显色液反应测定的吸光度与样品和浓硫酸反应完全冷却再加苯酚测定的吸光度的差值进行计算，在一定程度上减少了杂质干扰及系统误差，且避免了显色过程中由H2SO4放热反应而导致的误差;而DNS法可直接测定还原性单糖含量。

红芪是豆科植物多序岩黄芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz）的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血的功效[7]，其主要活性部位红芪多糖（hedysari polysaccharide，HPS）具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病等药理作用[8-9]。该研究结合差示苯酚-硫酸法和DNS法的特点，建立了测定红芪多糖的方法[10]，以期为红芪多糖等中药多糖的含量测定提供更好的参考方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 紫外分光光度仪（UV-3300型，上海美谱达仪器有限公司）;1/10000电子分析天平（AL104型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;超声仪（SB-5200DTD型，宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药 红芪原料药材购自甘肃省陇南市瑞达中药材专业合作社，产地甘肃省陇南市武都区柏林镇乡楼儿下村，经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定，系豆科植物多序岩黄芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz）的干燥根;红芪多糖（HPS），前期筛选优化的提取纯化工艺制得;D-无水葡萄糖标准品（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%，批号B21882）;蒸馏水;苯酚、硫酸、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠等其他试剂均为国产化学纯。

1.3 方法

1.3.1 差示苯酚-硫酸法测定总糖含量的方法建立[11-13]。

1.3.1.1 对照品溶液的制备。以蒸馏水配制浓度为0.428 mg/mL 的葡萄糖对照品溶液。

1.3.1.2 供试品溶液的制备。样品粉末10 mg以蒸馏水40 ℃超声20 min使其溶解，定容于25 mL容量瓶。

1.3.1.3 试液的制备。①显色剂的配制。将50 mL浓硫酸缓缓加入10 mL蒸馏水中，冷至室温后加苯酚0.6 g，搅拌溶解，低温保存，6 h内使用。②50 g/L苯酚溶液的配制。精密称取苯酚晶体5 g于棕色瓶，加100 mL蒸馏水溶解即得（该试液需新鲜配制，低温保存，6 h内使用）。③83.3%硫酸溶液的配制。精密量取50 mL浓硫酸加入10 mL蒸馏水中，摇匀，即得。

1.3.1.4 检测波长的选择。精密量取对照品溶液、样品溶液各1.0 mL分别置具塞试管，加蒸馏水补至2.0 mL，加显色剂5.0 mL，沸水浴反应30 min，取出，迅速冷至室温，精密加蒸馏水1.0 mL，摇匀，以相应试剂为空白，在400～800 nm扫描，得A1图。另精密量取对照品溶液、样品溶液各1.0 mL分别置具塞试管，加83.3%H2SO4溶液5.0 mL，沸水浴反应30 min，迅速冷至室温，精密加50 g/L苯酚溶液1.0 mL，摇匀，以相应试剂为空白，在400～800 nm扫描，得A2图。

1.3.1.5 显色条件的考察。

（1）显色剂用量的考察。精密量取多糖样品溶液7份于具塞试管中，0.6 mL/份，加蒸馏水补至2.0 mL，分别依次加入显色剂1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，沸水浴加热反应30 min，取出，迅速冷却至室温，精密加入蒸馏水1.0 mL，摇匀。以相应试剂为空白，按照分光光度法在“1.3.1.4”项下确定的检测波长处测定吸光度。

（2）反应时间的考察。精密量取多糖样品溶液7份于具塞试管中，0.6 mL/份，加蒸馏水补至2.0 mL，分别精密加入显色剂5.0 mL，置于沸水浴中，分别依次加热10、15、20、25、30、35、40 min，取出，迅速冷却至室温，精密加入蒸馏水1.0 mL，摇匀。以相应试剂为空白，按照分光光度法在“1.3.1.4”项下确定的检测波长处测定吸光度。